Smad4基因靜默促進PanIN細胞惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)基因的篩選及驗證.pdf

1、背景與目的：
　　 胰腺癌惡性程度高，預(yù)后極差。我們己建立的小鼠基因打靶模型證實，KrasG12D突變啟動了胰腺癌前病變胰腺導(dǎo)管上皮內(nèi)瘤變（pancreatic intraepithelial neoplasia, PanIN）。Smad4基因失活可使KrasG12D突變啟動的PanIN發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。但PanIN細胞中Smad4基因靜默后其下游基因表達將如何改變，進而促進PanIN細胞惡性轉(zhuǎn)化，目前尚不清楚?；诖?，本課題運用含

2、有41174條小鼠基因轉(zhuǎn)錄本的全基因表達譜芯片，研究Smad4基因靜默后PanIN細胞基因表達譜的變化。
　　 方法：
　　 1. 應(yīng)用小鼠全基因芯片檢測Smad4基因靜默前后PanIN細胞基因表達譜的變化（即PanIN細胞與PanIN-S細胞），對差異表達基因進行分析與功能注釋。并運用實時熒光定量多聚酶鏈反應(yīng)(Real-time PCR)對部分芯片結(jié)果進行驗證。
　　 2.在體外實驗中，運用Matrigel腫瘤

3、細胞侵襲試驗，檢測和比較Smad4基因靜默前后，PanIN細胞的侵襲與遷移能力。挑選腫瘤細胞侵襲與遷移相關(guān)差異表達基因，運用Real-time PCR及免疫印跡（West Blot）進行驗證。
　　 3. 動物實驗中，構(gòu)建PanIN及PanIN-S細胞組裸鼠移植瘤模型，繪制生長曲線，并運用Real-time PCR及免疫組化方法分析移植瘤新生血管形成相關(guān)差異表達基因的表達水平。
　　 結(jié)果：
　　 1.根據(jù)基因芯

4、片篩選出差異倍數(shù)2倍以上的差異表達基因共237條，上調(diào)148條，下調(diào)89條。通過Real-time PCR對部分結(jié)果的驗證表明，基因芯片的結(jié)果與Real-time PCR驗證結(jié)果基本一致。
　　 2.腫瘤細胞侵襲實驗結(jié)果顯示，Smad4基因靜默后的PanIN-S細胞侵襲與轉(zhuǎn)移能力明顯增強。Real-time PCR驗證結(jié)果顯示，PanIN-S細胞MMP2的mRNA水平顯著高于PanIN細胞（p<0.05）；PanIN-S細胞TI

5、MP4、PITX2的mRNA水平顯著低于PanIN細胞（p<0.05）。Western Blot結(jié)果顯示，PanIN-S細胞MMP2蛋白表達水平顯著高于PanIN細胞（p<0.05）；PanIN-S細胞TIMP4、PITX2蛋白表達水平顯著低于PanIN細胞（p<0.05）。
　　 3.動物模型結(jié)果顯示，PanIN-S組的移植瘤體積顯著高于PanIN組（p<0.05）；Real-time PCR驗證結(jié)果顯示，PanIN-S細胞P

6、IK3CB和CXCR4 mRNA水平顯著高于PanIN細胞（p<0.05）。免疫組化結(jié)果顯示，PanIN-S組PI3Kinase p110 beta與CXCR4表達水平顯著高于PanIN組（p<0.05）。
　　 結(jié)論：
　　 1.通過基因芯片技術(shù)篩選出Smad4基因靜默前后，即PanIN細胞與PanIN-S細胞差異表達基因，為后續(xù)體內(nèi)、外實驗奠定了良好的基礎(chǔ)。
　　 2.通過體外實驗表明，Smad4基因靜默可以