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文檔簡(jiǎn)介
1、背景與目的:
胰腺癌惡性程度高,預(yù)后極差。我們己建立的小鼠基因打靶模型證實(shí),KrasG12D突變啟動(dòng)了胰腺癌前病變胰腺導(dǎo)管上皮內(nèi)瘤變(pancreatic intraepithelial neoplasia, PanIN)。Smad4基因失活可使KrasG12D突變啟動(dòng)的PanIN發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。但PanIN細(xì)胞中Smad4基因靜默后其下游基因表達(dá)將如何改變,進(jìn)而促進(jìn)PanIN細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化,目前尚不清楚。基于此,本課題運(yùn)用含
2、有41174條小鼠基因轉(zhuǎn)錄本的全基因表達(dá)譜芯片,研究Smad4基因靜默后PanIN細(xì)胞基因表達(dá)譜的變化。
方法:
1. 應(yīng)用小鼠全基因芯片檢測(cè)Smad4基因靜默前后PanIN細(xì)胞基因表達(dá)譜的變化(即PanIN細(xì)胞與PanIN-S細(xì)胞),對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行分析與功能注釋。并運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量多聚酶鏈反應(yīng)(Real-time PCR)對(duì)部分芯片結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。
2.在體外實(shí)驗(yàn)中,運(yùn)用Matrigel腫瘤
3、細(xì)胞侵襲試驗(yàn),檢測(cè)和比較Smad4基因靜默前后,PanIN細(xì)胞的侵襲與遷移能力。挑選腫瘤細(xì)胞侵襲與遷移相關(guān)差異表達(dá)基因,運(yùn)用Real-time PCR及免疫印跡(West Blot)進(jìn)行驗(yàn)證。
3. 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,構(gòu)建PanIN及PanIN-S細(xì)胞組裸鼠移植瘤模型,繪制生長(zhǎng)曲線,并運(yùn)用Real-time PCR及免疫組化方法分析移植瘤新生血管形成相關(guān)差異表達(dá)基因的表達(dá)水平。
結(jié)果:
1.根據(jù)基因芯
4、片篩選出差異倍數(shù)2倍以上的差異表達(dá)基因共237條,上調(diào)148條,下調(diào)89條。通過Real-time PCR對(duì)部分結(jié)果的驗(yàn)證表明,基因芯片的結(jié)果與Real-time PCR驗(yàn)證結(jié)果基本一致。
2.腫瘤細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Smad4基因靜默后的PanIN-S細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移能力明顯增強(qiáng)。Real-time PCR驗(yàn)證結(jié)果顯示,PanIN-S細(xì)胞MMP2的mRNA水平顯著高于PanIN細(xì)胞(p<0.05);PanIN-S細(xì)胞TI
5、MP4、PITX2的mRNA水平顯著低于PanIN細(xì)胞(p<0.05)。Western Blot結(jié)果顯示,PanIN-S細(xì)胞MMP2蛋白表達(dá)水平顯著高于PanIN細(xì)胞(p<0.05);PanIN-S細(xì)胞TIMP4、PITX2蛋白表達(dá)水平顯著低于PanIN細(xì)胞(p<0.05)。
3.動(dòng)物模型結(jié)果顯示,PanIN-S組的移植瘤體積顯著高于PanIN組(p<0.05);Real-time PCR驗(yàn)證結(jié)果顯示,PanIN-S細(xì)胞P
6、IK3CB和CXCR4 mRNA水平顯著高于PanIN細(xì)胞(p<0.05)。免疫組化結(jié)果顯示,PanIN-S組PI3Kinase p110 beta與CXCR4表達(dá)水平顯著高于PanIN組(p<0.05)。
結(jié)論:
1.通過基因芯片技術(shù)篩選出Smad4基因靜默前后,即PanIN細(xì)胞與PanIN-S細(xì)胞差異表達(dá)基因,為后續(xù)體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)奠定了良好的基礎(chǔ)。
2.通過體外實(shí)驗(yàn)表明,Smad4基因靜默可以
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