同種異形抗原特異性iTreg預(yù)防小鼠GVHD保持GVL及其作用機(jī)理.pdf

1、目的：GVHD是造血干細(xì)胞移植最嚴(yán)重也最常見(jiàn)的并發(fā)癥。天然形成的調(diào)節(jié)T細(xì)胞(nTreg)能預(yù)防GVHD，但是nTreg的數(shù)量有限及其非選擇性抑制大大阻礙了nTreg在臨床上的應(yīng)用。為了解決這些難題，我們選擇了另一種方式即生成抗原特異性iTreg，并在臨床前期骨髓移植模型上測(cè)試他們預(yù)防GVHD的有效性和選擇性，同時(shí)觀察了其對(duì)GVL效應(yīng)的影響。
　　方法：選擇HY為目標(biāo)抗原，因?yàn)镠Y是Y染色體編碼，自然形成、在組織中廣泛表達(dá)的次要組織

2、相容性抗原，并被證明HY抗原在GVHD和GVL上發(fā)揮著重要作用。我們利用抗原提呈細(xì)胞結(jié)合HY抗原將幼稚T細(xì)胞在體外轉(zhuǎn)化成HY特異性iTreg并體外進(jìn)行混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)測(cè)試其抑制功能。然后在小鼠骨髓移植模型上觀察HY特異性iTreg對(duì)不同性別受鼠（雌性/雄性）GVHD的效應(yīng)及其作用機(jī)制。為了增加這種方法的臨床應(yīng)用前景，我們延伸這個(gè)研究到同種異基因抗原特異性iTregs。在一定濃度的IL-2、TGFβ、retinoic acid(RA)的條

3、件下，我們?cè)隗w外用同種異基因小鼠脾臟CD11 chi細(xì)胞(DCs)刺激小鼠CD4+CD25-細(xì)胞從而誘導(dǎo)生成同種異體抗原特異性iTreg。首先在體外測(cè)試其對(duì)反應(yīng)T細(xì)胞的抑制功能，然后我們?cè)谛∈笸N異基因骨髓移植模型上研究了這些iTregs對(duì)GVHD的預(yù)防功能和選擇特異性。接著，我們?cè)谛∈螽愺w骨髓移植的同時(shí)注入了螢光素酶轉(zhuǎn)導(dǎo)的淋巴瘤A20細(xì)胞從而觀察同種異體抗原特異性iTreg對(duì)GVL的影響。最后我們研究了iTregs分離GVHD和GVL

4、的作用機(jī)制。
　　結(jié)果：⑴在體外可以誘導(dǎo)CD4+CD25-幼稚T細(xì)胞生成抗原特異性iTregs。⑵在體外實(shí)驗(yàn)中，在HY抗原刺激的情況下HY抗原特異性iTregs能大大抑制反應(yīng)細(xì)胞的增殖。⑶當(dāng)Tregs:Teff比例相對(duì)較低時(shí)，HY抗原特異性iTregs預(yù)防雄性受鼠GVHD的發(fā)生，而在雌性受鼠中沒(méi)有這種保護(hù)作用。⑷HY抗原特異性iTregs在雄性受鼠體內(nèi)活化擴(kuò)增，并且抑制肝臟和脾臟中的效應(yīng)T細(xì)胞。⑸在BALB/c小鼠脾臟DCs刺激產(chǎn)

5、生的異體抗原特異性iTregs(BALB/c-iTreg)抑制功能體外實(shí)驗(yàn)中，我們觀察到當(dāng)被BALB/c異體抗原刺激時(shí)，BALB/c-iTregs顯著抑制效應(yīng)T細(xì)胞增殖，但當(dāng)被FVB（無(wú)關(guān)）異體抗原刺激時(shí)抑制效應(yīng)大大減低。⑹在B6→BALB/c骨髓移植小鼠模型中，BALB/c-iTreg能顯著延遲受鼠GVHD的發(fā)生并提高該組小鼠長(zhǎng)期存活率，相比較B10BR-iTreg對(duì)受鼠GVHD的預(yù)防作用大大減低。⑺我們還觀察到在B6→BALB/c骨

6、髓移植GVHD/GVL模型中，BALB/c-iTreg組小鼠的長(zhǎng)期存活率仍顯著高于Teff組，并且小鼠成像顯示iTreg沒(méi)有增加腫瘤復(fù)發(fā)。
　　結(jié)論：①大量的HY抗原特異性iTregs能在體外被誘導(dǎo)生成，這些iTregs在體外能特異性抑制效應(yīng)T細(xì)胞。我們觀察到在小鼠骨髓移植模型中HY抗原特異性iTregs能減少效應(yīng)T細(xì)胞在受鼠體內(nèi)的的擴(kuò)增、活化和浸潤(rùn)，從而以一種抗原依賴性的方式有效預(yù)防GVHD。②成功地在體外將幼稚T細(xì)胞誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化成