攜帶HBB基因shRNA的人臍血CD34+細(xì)胞構(gòu)建及其應(yīng)用基礎(chǔ)研究.pdf

1、β-血紅蛋白病是一組多相群的單基因疾病，重型可致死。為了探討其基因治療的可行性及潛在價(jià)值。本課題擬選擇對β-珠蛋白基因具有靶向RNAi的特異序列，并構(gòu)建慢病毒載體，采用體外篩選法獲得目的序列及質(zhì)粒，以期能與β-珠蛋白等位基因特異性結(jié)合抑制RNA的表達(dá)，并了解感染細(xì)胞的體內(nèi)植入和增殖情況，以期在以后試驗(yàn)中與其它基因表達(dá)載體組合共同用于治療β-血紅蛋白病。 內(nèi)容和方法： 1.從GeneBank查找HBB mRNA序列，設(shè)計(jì)挑

2、選3個(gè)RNAi靶點(diǎn)，每個(gè)合成兩條單寡核苷酸鏈，退火后連入酶切的pGCL-GFP載體，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)染感受態(tài)細(xì)菌，對長出的克隆進(jìn)行PCR鑒定，測序比對。對陽性克隆進(jìn)行質(zhì)粒抽提。 2.用PCR方法從模板釣取相應(yīng)的HBB序列片段，將片段與pdsRED2-N1載體進(jìn)行雙酶切后定向連接，轉(zhuǎn)染感受態(tài)細(xì)菌，長出的克隆進(jìn)行PCR鑒定，測序和比對分析后，對陽性克隆進(jìn)行質(zhì)粒抽提。 3.HBB-RNAi-LV質(zhì)粒和HBB過表達(dá)質(zhì)粒，按低濃度組(

3、0.5：1)和高濃度組(1：1)用Lipofectamine2000共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48h后FM觀察GFP表達(dá)，Western Blot檢測FLAG-HBB融合蛋白表達(dá)。 4.將HBB-RNAi-LV質(zhì)粒和慢病毒包裝載體pHelper1.0及pHelper2.0載體按4：3：2比例添加，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，培養(yǎng)48小時(shí)后收集培養(yǎng)上清，利用Plus-20離心超濾裝置對病毒上清進(jìn)行離心超濃縮。 5.人臍血MACS法分離的C

4、D34+細(xì)胞，加入細(xì)胞因子進(jìn)行無血清無基質(zhì)預(yù)培養(yǎng)，慢病毒感染，48h后FM觀察感染率，Real-Time PCR檢測感染2、4、5天的HBB\HBG基因表達(dá)情況，Western Blot檢測感染7天的HBB蛋白表達(dá)。 6.人臍血CD34+細(xì)胞，體外用高濃度細(xì)胞因子預(yù)刺激培養(yǎng)過夜后感染慢病毒24小時(shí)，經(jīng)皮注射入SCID新生小鼠腹腔，密切觀察小鼠存活情況。 7.移植后3周，用FM和FCM檢測小鼠外周血中人HbF細(xì)胞和成人紅細(xì)

5、胞，外周血有核細(xì)胞中的GFP陽性細(xì)胞；骨髓細(xì)胞中的GFP陽性細(xì)胞，并觀察小鼠肝、脾、腎臟、小腸等組織中的GFP陽性細(xì)胞分布。 結(jié)果： 1.構(gòu)建了3個(gè)HBB基因的RNAi-LV載體(PSC1、PSC2、PSC3)及一個(gè)對照質(zhì)粒PSCNC。 2.構(gòu)建了含有相應(yīng)HBB基因片段的過表達(dá)載體HBB-pdsRED2-N1-3Flag質(zhì)粒。 3.外源篩靶試驗(yàn)中PSC1、PSC3對HBB融合蛋白有明顯敲減作用，隨著濃度增

6、加敲減作用增強(qiáng)，其中PSC1靶點(diǎn)的敲減效果最好。 4.包裝并獲得高滴度的PSC1、PSC3和PSCNC慢病毒。 5.慢病毒在CD34+細(xì)胞中的感染率為15～30％，病毒感染明顯激活細(xì)胞中的HBB和HBG基因表達(dá)，PSC1促進(jìn)HBB珠蛋白表達(dá)，PSC3則顯著抑制HBB和HBG珠蛋白表達(dá)，其抑制效果與感染率有關(guān)。 6.移植CD34+細(xì)胞后，小鼠外周血中人HbF細(xì)胞及成人紅細(xì)胞為0.1～1.2％；有核細(xì)胞中GFP細(xì)胞，

7、PSCNC組為3.2～1.0.2％，PSC3組為4.4～8.8％；骨髓細(xì)胞中GFP細(xì)胞PSCNC組為1.5～5.5％，PSC3組為1.3～6.2％，各組間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。肝、脾、腎和小腸等組織均未見明顯的GFP陽性細(xì)胞。 結(jié)論： 1.系統(tǒng)建立了完整的人臍帶血CD34+細(xì)胞分離、無血清無基質(zhì)培養(yǎng)和慢病毒感染的實(shí)驗(yàn)方法。 2.成功構(gòu)建了3個(gè)β-珠蛋白基因shRNA的慢病毒載體，通過外源篩靶方法初篩出2個(gè)有效序列，經(jīng)慢