胞外HMGB1通過SDF-1-CXCR-4軸對臍血CD34+細胞的影響.pdf

1、目的:探索HMGB1(高遷移率族蛋白B1)和/或SDF-1(CXCL12,基質(zhì)細胞衍化因子)對臍血CD34+細胞的遷移、阻斷、粘附、克隆形成作用,并探討HMGB1是否通過SDF-1/CXCR-4軸促進臍血CD34+細胞的趨化作用。
　　方法:采集正常足月順產(chǎn)新生兒臍血標本,羥乙基淀粉沉淀紅細胞,通過淋巴細胞分離液得到臍血單個核細胞,顯微鏡(5×)下計數(shù)單個核細胞數(shù),使用CD34+免疫磁珠分選得到CD34+細胞,運用流式細胞儀檢測

2、CD34+細胞的純度。利用Transwell小室觀察細胞的運動,其中上孔添加含1*105/孔細胞液。利用不同濃度HMGB1和/或SDF-1(0,10,25,50,100,200ng/ml)檢測HMGB1和/或SDF-1介導(dǎo)臍血CD34+細胞遷移作用的最佳濃度。臍血CD34+細胞表達CXCR-4(SDF-1受體)與HMGB1受體RAGE。我們使用抗-SDF-1、抗CXCR-4、抗-RAGE抗體檢測HMGB1單獨或與SDF-1聯(lián)合對臍血CD

3、34+細胞遷移作用,進一步探討哪種受體是HMGB1和/或SDF-1遷移作用所必須的。將新鮮分選的CD34+細胞按照實驗要求加至已經(jīng)包被的96孔板中,同時按照分組情況將細胞因子SDF-1及HMGB1加至相應(yīng)孔,經(jīng)孵育、洗滌、再孵育、離心后,通過酶標儀檢測各個組的吸光度值。將0.9％甲基纖維素半固體培養(yǎng)基CFC加至24孔板中,每孔3ml,將CD34+細胞液(細胞數(shù)為1.0×105/孔)加入各組,每組300ul,5%CO2、37℃、飽和濕度的

4、孵箱中培養(yǎng)14d后,電子顯微鏡下(10×10)分別計數(shù)各組混合集落的生成,取平均值。
　　結(jié)果:1)磁珠分選的臍血單個核細胞中CD34+細胞純度為95%以上,臍血CD34+細胞大量表達受體CXCR-4,同時正常人外周血也表達CXCR-4受體。2)25ng/ml的SDF-1不介導(dǎo)臍血CD34+細胞的遷移運動,而其最佳趨化濃度為100ng/ml,100ng/ml系HMGB1單獨作用的適宜濃度。通過劑量實驗,我們發(fā)現(xiàn)100ng/mlHM

5、GB1聯(lián)合50ng/mlSDF-1可以更好的發(fā)揮協(xié)同作用（P<0.05)。3)阻斷實驗中抗SDF-1(4ug/ml)和抗-CXCR-4(5ug/ml)抗體可減弱HMGB1獨自或聯(lián)合SDF-1介導(dǎo)的趨化運動。同時抗-RAGE抗體可以明顯減弱HMGB1的單獨趨化作用,但是抗-RAGE抗體對SDF-1聯(lián)合HMGB1介導(dǎo)的臍血CD34+細胞趨化運動沒有顯著影響。4)粘附實中,與對照組相比,細胞因子SDF-1及HMGB1組均可以增加CD34+細胞

6、的吸光值,但兩種細胞因子的聯(lián)合作用并沒有較它們分別作用時有所提高(P>0.05)。5)與對照組相比,SDF-1組與HMGB1組均提高了CD34+細胞克隆數(shù),同時SDF-1聯(lián)合HMGB1組相對于它們分別作用時均明顯提高了細胞克隆數(shù)(P<0.05)。
　　結(jié)論:1)CD34+細胞大量表達CXCR-4受體,同時人外周血也表達CXCR-4受體。2)趨化實驗說明細胞因子SDF-1及HMGB1在濃度小于100ng/ml時,它們對細胞的趨化作用

7、與濃度呈正相關(guān),但在濃度進一步增加后,趨化作用不再增加。它們的最佳濃度均為100ng/ml,同時濃度為100ng/ml的HMGB1可以促進50ng/mlSDF-1的趨化遷移能力。3)阻斷實驗表明細胞因子HMGB1的遷移作用依賴于SDF-1/CXCR-4軸;受體RAGE參與部分遷移作用,但不起決定作用。4)粘附實驗說明細胞因子SDF-1及HMGB1均可以加強干細胞的粘附作用,但它們的聯(lián)合作用并不增加總體的粘附作用。5)克隆形成實驗表明細胞