RhoA-ROCK通路在PET編織材料介導(dǎo)小鼠BMSC遷移中的作用.pdf

1、研究背景
　　關(guān)節(jié)韌帶損傷在日常生活中較為常見,據(jù)統(tǒng)計(jì)在美國(guó)每年約有6‰的人發(fā)生前十字韌帶損傷,其中約半數(shù)需要手術(shù)重建。隨著現(xiàn)代關(guān)節(jié)外科的迅速發(fā)展,對(duì)人工韌帶材料的安全性和生物替代性的相關(guān)研究已成為目前關(guān)注的熱點(diǎn)問題,而材料介導(dǎo)下細(xì)胞的遷移是材料對(duì)細(xì)胞其它生物學(xué)功能影響的基礎(chǔ)。
　　人工材料的生物替代過程依賴于其對(duì)植入?yún)^(qū)生物細(xì)胞遷移的誘導(dǎo)性能,這是生物材料對(duì)細(xì)胞生物學(xué)功能產(chǎn)生影響的前提基礎(chǔ)。體內(nèi)細(xì)胞的遷移過程需經(jīng)歷四個(gè)步驟:

2、細(xì)胞首先通過與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)建立新的粘附連接,使細(xì)胞與ECM相固定,之后細(xì)胞前端沿遷移方向伸出片狀偽足,并與前方ECM粘附以維持伸張狀態(tài),隨后細(xì)胞內(nèi)的肌動(dòng)蛋白、肌球蛋白發(fā)揮作用調(diào)節(jié)細(xì)胞體的收縮,促使細(xì)胞向前運(yùn)動(dòng),最后細(xì)胞尾部與ECM分離并通過收縮將尾部抬起向前,完成遷移過程。大量研究表明,因生物材料本身性質(zhì)的不同,以及生物支架工程設(shè)計(jì)的不同,對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移等多種生物學(xué)功能均有一定影響。這提示我們,通過研究材料的生物學(xué)效應(yīng)和生物支

3、架空間結(jié)構(gòu)與細(xì)胞學(xué)之間的關(guān)系,將有助于進(jìn)一步提高材料的生物安全性和生物替代性,為臨床疾病的治療提供更好的手段。
　　以聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯(PET)纖維為原料研制的人工韌帶是目前關(guān)節(jié)外科修復(fù)重建損傷韌帶的重要材料。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)PET人工韌帶材料經(jīng)殼聚糖接枝改性后生物相容性和浸潤(rùn)性大大提高,提示改性后的新型PET材料具有作為人工韌帶的良好潛質(zhì),但將其編織物對(duì)細(xì)胞的生物學(xué)行為的影響尚待深入研究。人工韌帶在植入后,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

4、(BMSC)是植入?yún)^(qū)的主要細(xì)胞之一,其可在應(yīng)力作用下完成細(xì)胞定向分化,而BMSC向人工韌帶的遷移過程受材料編織物的微孔結(jié)構(gòu)、張力和生物相容性等諸多因素影響。因此,研究細(xì)胞在生物材料上的遷移能力及相關(guān)機(jī)制具有重要意義。
　　Rho家族小分子鳥苷三磷酸酶,是介導(dǎo)多種細(xì)胞生物學(xué)功能的重要分子信號(hào)通路之一,也是整合多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的共同信號(hào)分子,具有分子開關(guān)的作用。研究表明Rho家族在細(xì)胞骨架、基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞粘附的調(diào)控及多條信號(hào)通路的調(diào)

5、節(jié)中的調(diào)控作用不可或缺。Rho家族作為Ras超家族成員,是MAPK系統(tǒng)上游的一類重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子,其中對(duì)RhoA、Cdc42和Rac3個(gè)成員的主要作用機(jī)制研究相對(duì)明確。而RhoA在細(xì)胞遷移過程中發(fā)揮了非常重要的作用,它所介導(dǎo)的RhoA/ROCK通路被稱為是細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的“動(dòng)力馬達(dá)”。
　　RhoA為單體G蛋白,結(jié)構(gòu)序列相對(duì)保守。RhoA受固有的激活機(jī)制調(diào)控,RhoGTPases以無活性的結(jié)合GDP形式或有活性的結(jié)合GTP形式存在,通

6、過兩者間的相互轉(zhuǎn)換發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。RhoA活化后通過激活下游效應(yīng)分子ROCK來啟動(dòng)通路。ROCK是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,其激活后可以對(duì)下游底物進(jìn)行磷酸化。在細(xì)胞遷移時(shí),ROCK活化后可以對(duì)下游底物肌球蛋白輕鏈磷酸酶(Myosinlightchainphosphatase,MLCP)進(jìn)行磷酸化,或者直接對(duì)肌球蛋白輕鏈磷酸化。通過這兩種途徑增加了細(xì)胞內(nèi)肌球蛋白輕鏈的磷酸化水平,刺激了由肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白的交聯(lián),增強(qiáng)了肌動(dòng)蛋白收縮。ROCK還

7、可以激活LIM激酶,LIM激酶激活后可使肌動(dòng)蛋白解聚和切割因子失活。此外,ROCK還能激活絲切蛋白,從而增加和穩(wěn)定了肌動(dòng)蛋白絲。以上述信號(hào)通路的共同作用為核心,最終引起細(xì)胞發(fā)生遷移。
　　目的
　　1.建立可應(yīng)用于體外細(xì)胞在生物材料編織物上遷移的模型;
　　2.RhoA/ROCK信號(hào)通路在PET編織物介導(dǎo)小鼠BMSC遷移中的影響;
　　方法
　　1.利用醫(yī)用316L不銹鋼設(shè)計(jì)制作細(xì)胞遷移模具,置于六孔板,在

8、模具加樣孔內(nèi)接種小鼠BMSC,培養(yǎng)24h后撤出模具,分別繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h和72h;
　　2.在證實(shí)模具可有效用于量化細(xì)胞遷移過程后,將不同線密度經(jīng)改性的PET材料編織物平鋪于六孔板底,利用本模型觀察BMSC在3000D組和5000D組材料編織物上的遷移能力,吉姆薩染色法計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)BMSC的遷移面積;
　　3.建立在PET材料編織物上培養(yǎng)的小鼠BMSC的遷移模型,依材料不同分為3000DA編織方法組、3000DB編織

9、方法組、5000DA編織方法組和5000DB編織方法組,分別培養(yǎng)96h后采用吉姆薩染色法和Westernblot法觀察細(xì)胞的遷移過程及RhoA蛋白的表達(dá)變化;
　　4.用濃度分別為0、5、10、20μmol/L的ROCK激酶抑制劑Y27632處理小鼠BMSC,在5000DA編織方法PET材料上培養(yǎng)96h,利用吉姆薩染色法和Westernblot法觀察細(xì)胞遷移的快慢及其對(duì)RhoA、ROCK和p-MLC蛋白表達(dá)的影響。
　　結(jié)果

10、
　　1.細(xì)胞接種24h后取出模具,見六孔板底中央?yún)^(qū)出現(xiàn)與模具底面大小相當(dāng)?shù)臒o細(xì)胞區(qū)。隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),BMSC逐漸由周圍向中央?yún)^(qū)域遷移;
　　2.在經(jīng)改性的PET材料編織物上成功建立細(xì)胞遷移模型后,吉姆薩染色提示,隨培養(yǎng)時(shí)間增加,兩組細(xì)胞遷移面積均逐漸增大,其中3000D組細(xì)胞遷移面積顯著大于5000D組(P<0.05);
　　3.吉姆薩染色法發(fā)現(xiàn),5000DA編織方法組細(xì)胞遷移面積明顯優(yōu)于其余3組(P<0.05),3

11、000DA編織方法組次之,5000DB編織方法組優(yōu)于3000DB編織方法組。Westernblot結(jié)果提示RhoA蛋白表達(dá)量的變化趨勢(shì)與吉姆薩染色相同;
　　4.在5000DA編織方法的PET編織物上建立細(xì)胞遷移模型,應(yīng)用ROCK激酶抑制劑Y27632后,吉姆薩染色及Westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),隨Y27632抑制劑濃度增高,其細(xì)胞的遷移面積逐漸減小,RhoA蛋白、ROCK蛋白和p-MLC蛋白表達(dá)量下降(P<0.05)。