RhoA-ROCK信號轉導通路抑制劑-C3轉移酶和法舒地爾抑制大鼠肝星狀細胞遷移.pdf

1、肝纖維化(hepatic fibrosis)是機體對慢性肝損傷的創(chuàng)傷．愈合反應，是各種慢性肝病發(fā)展至肝硬化的中間環(huán)節(jié)和前期病變。因此，探討肝纖維化的發(fā)病機制為其治療提供可靠依據、早期逆轉肝纖維化具有重要的臨床價值。肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)在肝纖維化的形成中起關鍵作用。在肝損傷及各種慢性肝病時，HSC 被激活，轉換為肌成纖維細胞(myofibroblastic like cells)，表達α-平滑肌

2、肌動蛋白(α-smooth muscleactin，α-SMA)，合成各種細胞外基質成分，并且具有舒縮、黏附和定向遷移的能力。各種細胞因子和細胞信號轉導途徑在 HSC 活化過程中起著非常重要的作用。 RboA家族蛋白是細胞骨架肌動蛋白的重要調節(jié)分子，并作為信號分子參與眾多與細胞骨架有關的細胞信號傳導。RhoA 主要增加細胞的收縮力，促進粘著斑連接和應力纖維的裝配。Rho 激酶(Rho-kinase，ROCK)是目前研究最清楚的R

3、hoA 下游效應分子，作用于肌球蛋白輕鏈磷酸酶(myosin light chain phosphatase，MLCP)使其失活，使胞漿內肌球蛋白輕鏈(myosin light chain，MLC)磷酸化水平升高，肌動-肌球蛋白交聯增加，從而促進肌動蛋白微絲骨架的聚合，引起細胞收縮、黏附和遷移。 Rho 蛋白與GTP結合后呈激活狀態(tài)，與GDP結合呈失活狀態(tài)。溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid，LPA)是第一個

4、被發(fā)現能激活Rho的物質；C3轉移酶(C3 transferase)引起的ADP核糖基化可使Rho蛋白失活；法舒地爾(fasudil)是 ROCK 抑制劑。近年來有研究證實Rho。家族蛋白在細胞遷移中發(fā)揮重要作用，Rho信號通路相關的細胞遷移與心血管、腫瘤和纖維化疾病有關。我們以前的研究工作發(fā)現整合素(integrin)-黏著斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)信號途徑參與HSC的遷移過程，黏著斑相關非激酶(fo

5、cal adhesion related non-kinase，FRNK)對HSC 遷移具有抑制作用。對整合素信號通路研究發(fā)現，基質不斷提供信號給遷移細胞Rho蛋白影響細胞遷移。而RhoA/ROCK信號轉導通路對HSC的行為影響尚不清楚。 本課題從活化的HSC細胞生物學基礎研究出發(fā)，結合整體和離體試驗，探討RhoA/ROCK信號通路在肝纖維化形成中的作用以及對 HSC 形態(tài)、遷移和黏附的影響，為臨床肝纖維化的治療提供理論依據。實

6、驗共分三部分。 第一部分：大鼠肝纖維化組織Rboa、p-MLC和α-SMA 的動態(tài)表達 目的：觀察RhoA/ROCK 信號轉導通路關鍵信號分子RhoA、磷酸化的肌球蛋白輕鏈(phosphorylated myosin light chain，p-MLC(Thr18/Ser19))在實驗性肝纖維化大鼠不同階段肝組織中的表達規(guī)律，同時觀察細胞骨架成分α-SMA在肝纖維化大鼠肝組織中的表達變化，探討RhoA/ROCK 信號轉導

7、通路在肝纖維化發(fā)生中的作用。 方法：采用膽總管結扎(bile duct ligation，BDL)方法建立大鼠肝纖維化模型；分別與手術后1 wk、2wk、3wk、4wk 麻醉動物，假手術組4wk麻醉動物，留取肝組織；HE及Masson三色染色觀察肝纖維化大鼠的病理組織學變化；用免疫組織化學和 Western blot 檢測RhoA、 p-MLC和α-SMA 的表達，用逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測RhoA 的表達。

8、 結果：①肝纖維化大鼠動物模型的建立：HE 及Masson三色染色顯示：假手術組肝小葉結構完整，肝板排列整齊。模型組隨著肝纖維化逐漸發(fā)展，出現肝臟廣泛結締組織增生，中央靜脈周圍出現膠原纖維沉積，肝小葉結構紊亂甚至形成假小葉。②免疫組織化學顯示：假手術組大鼠肝臟RhoA呈陰性表達，造模 1 周匯管區(qū)間質細胞呈弱陽性表達，2～3周后，著色細胞逐漸增多，在匯管區(qū)、纖維間隔、肝竇周圍及增生的膽管周圍細胞出現棕黃色著色，第4周著色面積進一步擴

9、大，少數細胞可見細胞質陽性染色；造模1wk、2 wk、3 wk、4 wk大鼠肝組織內RhoA陽性分布面積為5.32％±0.41％，13.43％±2.13％，22.14％±3.22％，31.48％±2.31％，均顯著高于對照組(0.23％±0.14％)，P<0.05。免疫組織化學顯示假手術組大鼠肝臟α-SMA在血管壁平滑肌細胞有弱陽性表達，隨著纖維化進展，陽性著色細胞逐漸增多，匯管區(qū)、Disse 間隙、纖維間隔及增生的膽管周圍細胞出現棕黃

10、色著色。正常大鼠肝組織中p-MLC 僅在血管壁平滑肌細胞有弱陽性表達；隨著肝纖維化的進展，血管壁表達增強，尤其以靜脈血管壁明顯，并在肝竇周圍出現陽性表達細胞；造模1wk、2 wk、3 wk、4 wk大鼠肝組織內p—MLC陽性分布面積為13.47％±1.02％，20.05％±2.22％，28.31％±2.05％，35.41％±3.08％，與假手術組(2.01％±0.51％)比較，均有顯著性差異，p<0.05。③假手術組、BDL 組在503

11、bp處出現了RhoA基因的特異性條帶，375 bp處出現了內參照β-actin 的條帶。通過對電泳條帶光密度掃描分析，假手術組大鼠肝臟有弱RhoA 基因表達(43.23％±5.03％)；與假手術組比較，BDL 組隨著造模時間延長，RhoA 基因表達逐漸上調；造模1wk、2 wk、3 wk、4 wk基因表達分別為71.22％±1.06％，78.49％±2.24％，81.31％±3.21％，96.38％±2.12％，與假手術組比較均有統計學

12、意義，p<0.05；造模4 wk RhoA mRNA 表達是假手術組的2.23倍。④Western blot在24kD的位置上出現了陽性雜交帶，為RhoA的蛋白表達。從雜交信號的強度可知，假手術組大鼠肝組織中有微弱RhoA蛋白表達，隨著造模時間延長，蛋白表達逐漸增加，1～4 wk分別增加了4.34倍、9.95倍、19.85倍、22.12倍。Western blot分析顯示在1 8 kD 的位置上出現陽性雜交帶為p-MLC 的蛋白表達，從

13、雜交信號的強度可知，假手術組大鼠肝組織中有少量p-MLC 表達，隨著肝纖維化加重表達逐漸增加，4 wk達高峰，是1 wk的5.00倍，假手術組的43.16倍。在43kD的位置上出現的陽性雜交帶為α-SMA 蛋白表達，造模1～4 wk表達呈上升趨勢，1～4 wk蛋白表達分別是假手術組的2.37倍，7.08倍，13.14倍和17.62倍，與對照組比較均有顯著性差異，P<0.05。RhoA、p-MLC 分別與α-SMA 呈顯著性正相關(r=0

14、.98，P<0.01，r=0.976，P<0.01)。 結論：肝纖維化形成過程中RhoA、p-MLC和α-SMA 表達逐漸增加，提示RhoA/ROCK 信號轉導通路和細胞骨架的變化在肝纖維化形成與發(fā)展中起一定作用。 第二部分：C3轉移酶和法舒地爾對大鼠肝星狀細胞黏附和遷移的影響 目的：觀察RhoA 信號通路激動劑LPA、RhoA抑制劑-C3 轉移酶和ROCK抑制劑-fasudil對 HSC 遷移和黏附的影響。

15、 方法：本研究應用體外細胞培養(yǎng)技術，采用甲苯胺藍法了解LPA 誘導HSC黏附的情況和C3轉移酶及fasudil對HSC黏附的抑制作用；采用改良的Boyden雙腔系統了解LPA對HSC遷移的誘導作用和C3轉移酶及fasudil 對HSC遷移的抑制作用；應用激光共聚焦顯微鏡觀察C3轉移酶及fasudil 對HSC遷移的抑制作用；應用激光共聚焦顯微鏡觀察C3轉移酶及fasudil對HSC形態(tài)的影響。 結論：RhoA/ROCK信號轉

16、導通路抑制劑C3轉移酶和fasudil對LPA誘導的HSC增殖、黏附和遷移具有抑制作用。 第三部分：RhoA/ROCK信號轉導通路對大鼠HSC遷移影響的機制研究 目的：探討RhoA/ROCK信號轉導通路抑制劑對LPA誘導的HSC黏附、遷移抑制作用的分子機制。 方法：本研究應用體外細胞培養(yǎng)技術，采用Western blot和RT-PCR共擴增技術檢測RhoA、p-MLC和α-SMA 的表達情況。用激光掃描共聚焦顯微

17、鏡(LSCM)檢驗細胞[C<,a><'2+>]。 結論：活化的HSC表達RhoA/ROCK信號通路關鍵信號分子RhoA和p-MLC。RhoA抑制劑-C3轉移酶對HSC RhoA 蛋白表達有明顯抑制作用，并且從基因水平抑制其合成，同時抑制了RhoA/ROCK下游信號分子p-MLC的表達，對細胞骨架成分α-SMA 的表達有抑制作用；ROCK抑制劑-fasudil對p-MLC和α-SMA 的表達均有抑制作用，并呈現濃度依賴關系。應用R