辛伐他汀通過抑制轉(zhuǎn)β分泌酶HEK293細胞RhoA-ROCK途徑減少Aβ42的生成.pdf

1、阿爾茨海默病主要發(fā)生在老年前期和老年期，臨床上主要以進行性的認知功能受損和行為改變?yōu)樘卣鞅憩F(xiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。關(guān)于阿爾茨海默病的發(fā)病確切發(fā)病機制尚不明確，但目前居于主導地位并研究較為成熟的機制之一是細胞外β-淀粉樣蛋白的生成和清除失衡。已往研究顯示長期應用他汀類藥物能夠降低阿爾茨海默病的發(fā)病風險，大部分研究圍繞降脂途徑對β-淀粉樣蛋白生成的影響，其通過降脂以外途徑影響β-淀粉樣蛋白的生成近年來逐漸也成為熱點。研究證明非甾體抗炎藥

2、物可以通過影響細胞膜上小G蛋白RhoA的定位及下游蛋白激酶ROCK的活化，減少β-淀粉樣蛋白的生成。他汀類藥物除降脂外可抑制異戊二烯小分子的生成，其是Rho蛋白翻譯后修飾的重要物質(zhì)，而Rho蛋白只有翻譯修飾后才能膜定位，發(fā)揮其信號轉(zhuǎn)導功能。他汀類藥物是否同樣可以通過這一途徑對β-淀粉樣蛋白的生成產(chǎn)生影響，尚不明確。甲羥戊酸為膽固醇和異戊二烯小分子的前體，有文獻表明，在細胞外液高膽固醇的條件下，加入低濃度的甲羥戊酸能恢復異戊二烯化途徑，而

3、不影響細胞內(nèi)膽固醇含量。我們在保持細胞外液膽固醇含量充分條件下，把細胞分為對照組、他汀類藥物組和他汀類藥物加甲羥戊酸組，然后分析不同分組對細胞膜RhoA蛋白膜定位影響，并同時觀察細胞內(nèi)信號下游效應分子ROCK的激活狀態(tài)。提取每組的細胞外液做β-淀粉樣蛋白含量分析，觀察其分泌量情況。綜合上述觀察他汀類藥物通過RhoA/ROCK信號轉(zhuǎn)導途徑對細胞分泌β-淀粉樣蛋白含量的影響，從而分析是否能對阿爾茨海默病起到一定的防治作用。
　　 研

4、究目的:
　　 保證培養(yǎng)環(huán)境膽固醇充分條件下，觀察他汀類藥物通過RhoA/ROCK途徑對轉(zhuǎn)β分泌酶HEK293細胞分泌β-淀粉樣蛋白的影響。
　　 研究方法:
　　 1.BACE1-HEK293細胞培養(yǎng)及實驗分組:RMPI1640培養(yǎng)基，1OOU/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素，參照文獻方法給予10％的胎牛血清保證細胞培養(yǎng)環(huán)境膽固醇含量充足。于37℃，含5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)。培養(yǎng)細胞達到一定數(shù)量后，根

5、據(jù)甲羥戊酸可恢復異戊二烯化途徑和下述的MTT結(jié)果分為空白對照組、1μmol/L辛伐他汀藥物濃度的處理組、1μmol/L辛伐他汀+250μmol/L甲羥戊酸藥物處理組、5μmol/辛伐他汀藥物處理組、5μmol/L辛伐他汀+250μmol/L甲羥戊酸藥物處理組。
　　 2.MTT檢測細胞活性:將細胞以每孔5×103接種于96孔板中，待細胞達到孔板中70％-80％時，如上述細胞分組處理，當藥物處理細胞24h后，每孔加入MTT(5g/

6、L)20μl，37℃孵育4h，棄去培養(yǎng)液，再每孔加入100μLDMSO，震蕩1Omin，酶標儀（BIO-RADModel680型）于550nmol/L波長處測定吸光光度值。
　　 3.COD-PAP法測定細胞內(nèi)膽固醇:待細胞長滿至培養(yǎng)孔的80％左右后，用異丙醇提取細胞內(nèi)膽固醇，以膽固醇與總蛋白的比值做為膽固醇水平。
　　 4.ELISA法檢測:收集作用24小時各個處理組的上清液1mL，加入10μl的PMSF，12000r

7、pm4℃高速離心。取上清50μl為待測樣品。ELISA檢測Aβ42的分泌量。
　　 5.Westernblot法檢測:提取各個處理組細胞膜蛋白和細胞漿蛋白，BCA蛋白測定試劑盒測定提取的蛋白濃度，westernblot檢測細胞膜上RhoA及細胞漿T696位點磷酸化肌球蛋白磷酸酶肌球蛋白結(jié)合亞基(p-MYPT1)表達量變化。
　　 結(jié)果:
　　 1.MTT結(jié)果表明各組細胞存活率無差異學統(tǒng)計意義，各個處理組藥物濃度對

8、細胞存活率影響不大。
　　 2.1、5μmol/L辛伐他汀組作用24h后細胞內(nèi)膽固醇含量較對照組無明顯變化。
　　 3.ELISA法顯示1μmol/LSim、5μmol/LSim處理組細胞分泌Aβ42量較對照組顯著減少，分別加入250μmol/LMev后能恢復至對照組水平。
　　 4.Westernblot檢測出1μmol幾Sim、5μmol/LSim處理組細胞膜上RhoA及細胞漿p-MYPT1含量較對照組顯著降

9、低，分別加入250μmol/LMev后能夠?qū)筍im的作用。
　　 結(jié)論:
　　 1.他汀類藥物可以通過降低膽固醇以外的途徑減少RhoA蛋白的細胞膜定位和下游激酶ROCK的活化。
　　 2.他汀類藥物抑制細胞外液Aβ42的分泌量可能和RhoA/ROCK途徑有關(guān)聯(lián)。
　　 研究意義:
　　 本課題實驗體外初步證明了他汀類藥物對細胞β-淀粉樣蛋白的代謝途徑有影響，可能與RhoA/ROCK信號轉(zhuǎn)導通路有