辛伐他汀通過(guò)抑制轉(zhuǎn)β分泌酶HEK293細(xì)胞RhoA-ROCK途徑減少Aβ42的生成.pdf

1、阿爾茨海默病主要發(fā)生在老年前期和老年期，臨床上主要以進(jìn)行性的認(rèn)知功能受損和行為改變?yōu)樘卣鞅憩F(xiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。關(guān)于阿爾茨海默病的發(fā)病確切發(fā)病機(jī)制尚不明確，但目前居于主導(dǎo)地位并研究較為成熟的機(jī)制之一是細(xì)胞外β-淀粉樣蛋白的生成和清除失衡。已往研究顯示長(zhǎng)期應(yīng)用他汀類(lèi)藥物能夠降低阿爾茨海默病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，大部分研究圍繞降脂途徑對(duì)β-淀粉樣蛋白生成的影響，其通過(guò)降脂以外途徑影響β-淀粉樣蛋白的生成近年來(lái)逐漸也成為熱點(diǎn)。研究證明非甾體抗炎藥

2、物可以通過(guò)影響細(xì)胞膜上小G蛋白R(shí)hoA的定位及下游蛋白激酶ROCK的活化，減少β-淀粉樣蛋白的生成。他汀類(lèi)藥物除降脂外可抑制異戊二烯小分子的生成，其是Rho蛋白翻譯后修飾的重要物質(zhì)，而Rho蛋白只有翻譯修飾后才能膜定位，發(fā)揮其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能。他汀類(lèi)藥物是否同樣可以通過(guò)這一途徑對(duì)β-淀粉樣蛋白的生成產(chǎn)生影響，尚不明確。甲羥戊酸為膽固醇和異戊二烯小分子的前體，有文獻(xiàn)表明，在細(xì)胞外液高膽固醇的條件下，加入低濃度的甲羥戊酸能恢復(fù)異戊二烯化途徑，而

3、不影響細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量。我們?cè)诒３旨?xì)胞外液膽固醇含量充分條件下，把細(xì)胞分為對(duì)照組、他汀類(lèi)藥物組和他汀類(lèi)藥物加甲羥戊酸組，然后分析不同分組對(duì)細(xì)胞膜RhoA蛋白膜定位影響，并同時(shí)觀(guān)察細(xì)胞內(nèi)信號(hào)下游效應(yīng)分子ROCK的激活狀態(tài)。提取每組的細(xì)胞外液做β-淀粉樣蛋白含量分析，觀(guān)察其分泌量情況。綜合上述觀(guān)察他汀類(lèi)藥物通過(guò)RhoA/ROCK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對(duì)細(xì)胞分泌β-淀粉樣蛋白含量的影響，從而分析是否能對(duì)阿爾茨海默病起到一定的防治作用。
　　 研

4、究目的:
　　 保證培養(yǎng)環(huán)境膽固醇充分條件下，觀(guān)察他汀類(lèi)藥物通過(guò)RhoA/ROCK途徑對(duì)轉(zhuǎn)β分泌酶HEK293細(xì)胞分泌β-淀粉樣蛋白的影響。
　　 研究方法:
　　 1.BACE1-HEK293細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組:RMPI1640培養(yǎng)基，1OOU/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素，參照文獻(xiàn)方法給予10％的胎牛血清保證細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境膽固醇含量充足。于37℃，含5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)細(xì)胞達(dá)到一定數(shù)量后，根

5、據(jù)甲羥戊酸可恢復(fù)異戊二烯化途徑和下述的MTT結(jié)果分為空白對(duì)照組、1μmol/L辛伐他汀藥物濃度的處理組、1μmol/L辛伐他汀+250μmol/L甲羥戊酸藥物處理組、5μmol/辛伐他汀藥物處理組、5μmol/L辛伐他汀+250μmol/L甲羥戊酸藥物處理組。
　　 2.MTT檢測(cè)細(xì)胞活性:將細(xì)胞以每孔5×103接種于96孔板中，待細(xì)胞達(dá)到孔板中70％-80％時(shí)，如上述細(xì)胞分組處理，當(dāng)藥物處理細(xì)胞24h后，每孔加入MTT(5g/

6、L)20μl，37℃孵育4h，棄去培養(yǎng)液，再每孔加入100μLDMSO，震蕩1Omin，酶標(biāo)儀（BIO-RADModel680型）于550nmol/L波長(zhǎng)處測(cè)定吸光光度值。
　　 3.COD-PAP法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)膽固醇:待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)至培養(yǎng)孔的80％左右后，用異丙醇提取細(xì)胞內(nèi)膽固醇，以膽固醇與總蛋白的比值做為膽固醇水平。
　　 4.ELISA法檢測(cè):收集作用24小時(shí)各個(gè)處理組的上清液1mL，加入10μl的PMSF，12000r

7、pm4℃高速離心。取上清50μl為待測(cè)樣品。ELISA檢測(cè)Aβ42的分泌量。
　　 5.Westernblot法檢測(cè):提取各個(gè)處理組細(xì)胞膜蛋白和細(xì)胞漿蛋白，BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定提取的蛋白濃度，westernblot檢測(cè)細(xì)胞膜上RhoA及細(xì)胞漿T696位點(diǎn)磷酸化肌球蛋白磷酸酶肌球蛋白結(jié)合亞基(p-MYPT1)表達(dá)量變化。
　　 結(jié)果:
　　 1.MTT結(jié)果表明各組細(xì)胞存活率無(wú)差異學(xué)統(tǒng)計(jì)意義，各個(gè)處理組藥物濃度對(duì)

8、細(xì)胞存活率影響不大。
　　 2.1、5μmol/L辛伐他汀組作用24h后細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量較對(duì)照組無(wú)明顯變化。
　　 3.ELISA法顯示1μmol/LSim、5μmol/LSim處理組細(xì)胞分泌A(yíng)β42量較對(duì)照組顯著減少，分別加入250μmol/LMev后能恢復(fù)至對(duì)照組水平。
　　 4.Westernblot檢測(cè)出1μmol幾Sim、5μmol/LSim處理組細(xì)胞膜上RhoA及細(xì)胞漿p-MYPT1含量較對(duì)照組顯著降

9、低，分別加入250μmol/LMev后能夠?qū)筍im的作用。
　　 結(jié)論:
　　 1.他汀類(lèi)藥物可以通過(guò)降低膽固醇以外的途徑減少RhoA蛋白的細(xì)胞膜定位和下游激酶ROCK的活化。
　　 2.他汀類(lèi)藥物抑制細(xì)胞外液Aβ42的分泌量可能和RhoA/ROCK途徑有關(guān)聯(lián)。
　　 研究意義:
　　 本課題實(shí)驗(yàn)體外初步證明了他汀類(lèi)藥物對(duì)細(xì)胞β-淀粉樣蛋白的代謝途徑有影響，可能與RhoA/ROCK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有