代謝型谷氨酸受體5-脂多糖作用小膠質(zhì)細胞的全新靶點初步研究.pdf

1、正常中樞神經(jīng)系統(tǒng)因血腦屏障的存在使免疫系統(tǒng)的成分不能進入，被認為是免疫特免區(qū)。然而，越來越多的證據(jù)顯示，中樞與免疫系統(tǒng)存在著相互作用。神經(jīng)通路參與了細胞與體液免疫反應(yīng)的調(diào)控，而免疫系統(tǒng)也主要通過細胞因子來影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能。中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)有免疫受體的分布，而免疫系統(tǒng)也有神經(jīng)受體的表達，它們共用一套相同的信號分子（神經(jīng)遞質(zhì)，神經(jīng)肽，細胞因子等）。長久以來，神經(jīng)-免疫間相互作用的研究都局限于其信號分子與受體間的作用，在神經(jīng)細胞上往往同時

2、有免疫受體的表達，而在免疫細胞，特別是小膠質(zhì)細胞上同樣也可見到神經(jīng)受體的表達，那么在這兩類受體之間除通過神經(jīng)遞質(zhì)或免疫因子產(chǎn)生相互作用外，是否在受體蛋白之間存在直接的相互作用，目前尚未見相關(guān)報道。為此，本研究，擬以腦小膠質(zhì)細胞為切入點，就小膠質(zhì)細胞免疫受體與神經(jīng)受體是否存在直接的蛋白作用進行探討，期望所獲結(jié)果能有助于我們更好地理解神經(jīng)系統(tǒng)-免疫系統(tǒng)之間的聯(lián)系，并為臨床相關(guān)疾病的防治提供有益的理論基礎(chǔ)。
　　小膠質(zhì)細胞廣泛分布于中樞

3、神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，參與腦內(nèi)的固有免疫反應(yīng)，構(gòu)成中樞神經(jīng)系統(tǒng)抵御病原體入侵的第一防線，被認為是正常中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最有代表性的免疫細胞。小膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損傷后最早發(fā)生反應(yīng)的細胞類型。中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多種病理狀態(tài)如創(chuàng)傷，中風(fēng)，炎癥反應(yīng)和神經(jīng)退行性疾病等，均可激活小膠質(zhì)細胞，啟動固有免疫反應(yīng)，產(chǎn)生多種細胞因子及炎癥趨化因子，進而導(dǎo)致各種白細胞穿過血腦屏障到達炎癥反應(yīng)區(qū)域。神經(jīng)元-小膠質(zhì)細胞間的相互作用在控制小膠質(zhì)細胞的功能及其激活方面起到了重

4、要的作用。小膠質(zhì)細胞上表達各種神經(jīng)遞質(zhì)受體來，感受神經(jīng)元釋放的神經(jīng)遞質(zhì)，調(diào)控小膠質(zhì)細胞的活性，并進一步對神經(jīng)元上的相關(guān)受體作用從而影響神經(jīng)元的功能。小膠質(zhì)細胞在神經(jīng)-免疫相互作用中起到了至關(guān)重要的作用。
　　小膠質(zhì)細胞上有多種神經(jīng)遞質(zhì)受體(D2DR，NMDAR1，mGluR5等)和天然免疫受體(TLR4)的表達，弄清這些受體在炎癥反應(yīng)時的相互作用，對炎癥機制的了解會起到很大的推動作用。本實驗以LPS刺激小膠質(zhì)細胞為炎癥模型，使用了

5、三種小膠質(zhì)細胞，1 TLR4正常的小膠質(zhì)細胞株N9;2 TLR4缺陷的小膠質(zhì)細胞株EOC20;3 TLR4缺失的原代小膠質(zhì)細胞。研究了上述免疫受體及神經(jīng)遞質(zhì)受體在炎癥反應(yīng)時的相互作用關(guān)系。
　　實驗從研究炎癥狀態(tài)時小膠質(zhì)細胞上天然免疫受體(TLR4)與神經(jīng)遞質(zhì)受體(D2DR，NMDAR1)間相互作用入手，通過免疫共沉淀，熒光共定位及熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)技術(shù)證實了免疫受體TR4與神經(jīng)遞質(zhì)受體NMDAR1受體間存在蛋白質(zhì)相互作

6、用后，進一步的功能實驗發(fā)現(xiàn)LPS刺激能引發(fā)小膠質(zhì)細胞的鈣振蕩現(xiàn)象，這種鈣振蕩與小膠質(zhì)細胞上表達的mGluR5受體有關(guān)。后續(xù)實驗圍繞mGluR5受體，利用免疫共沉淀，F(xiàn)RET，免疫熒光共定位，NF-κB報告基因及ELISA等相關(guān)技術(shù)，研究了mGluR5受體在LPS刺激小膠質(zhì)細胞時的作用及其與LPS，NMDAR1，TLR4間的相互關(guān)系，得到結(jié)果如下:
　　主要結(jié)果和結(jié)論:
　　1、N9，EOC20小膠質(zhì)細胞株上有多巴胺D2受體(

7、D2DR)的表達，LPS刺激后其表達量增高，但免疫共沉淀實驗未檢測到TLR4/D2DR受體間的蛋白質(zhì)相互作用;
　　2、N9，EOC20小膠質(zhì)細胞株上有免疫受體TLR4受體的表達，N9，EOC20細胞株及TLR4缺失的原代小膠質(zhì)細胞上均有谷氨酸受體mGluR5及NMDAR1受體的表達，小膠質(zhì)細胞上的免疫與神經(jīng)受體的共表達為神經(jīng)與免疫系統(tǒng)間的聯(lián)系奠定了物質(zhì)基礎(chǔ);
　　3、LPS刺激N9，EOC20小膠質(zhì)細胞株時，LPS能與mG

8、luR5受體直接結(jié)合，提示LPS在作用于小膠質(zhì)細胞時存在TLR4以外的信號通路;
　　4、LPS刺激N9，EOC20細胞株及TLR4缺失的原代小膠質(zhì)細胞均能引發(fā)熒光鈣振蕩;這種振蕩依賴于細胞內(nèi)的游離鈣離子，并能被mGluR5受體拮抗劑所拮抗。結(jié)果提示LPS刺激通過小膠質(zhì)細胞時通過直接作用于mGluR5受體，引發(fā)小膠質(zhì)細胞的熒光鈣振蕩;
　　5、LPS刺激N9，EOC20細胞株及TLR4缺失的原代小膠質(zhì)細胞后，能夠引發(fā)NMDA

9、R1受體的Ser896位點的磷酸化，這種磷酸化能被mGluR5受體拮抗劑所拮抗。結(jié)果提示LPS刺激小膠質(zhì)細胞，可直接作用于mGluR5受體引發(fā)了NMDAR1受體的磷酸化過程;
　　6、LPS刺激N9，EOC20小膠質(zhì)細胞株，能引發(fā)TLR4/NMDAR1間的蛋白質(zhì)相互作用，這種相互作用能被mGluR5受體拮抗劑所拮抗;
　　7、LPS刺激N9，EOC20小膠質(zhì)細胞株時，通過作用于mGluR5受體，能增強NF-κB的活性。提示L

10、PS作用于小膠質(zhì)細胞時，存在TLR4以外的活化NF-κB的途徑;
　　8、對mGluR5受體的激活，能抑制LPS刺激N9細胞導(dǎo)致的TNF-α分泌增高。提示mGluR5受體參與了抗炎反應(yīng)，可能成為調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的新的靶點。
　　綜上所述，我們的研究證實了在小膠質(zhì)細胞上，LPS除了經(jīng)典的TLR4信號通路以外，還存在mGluR5受體這個新的作用靶點，LPS通過這個靶點，活化了NF-κB，通過某種機制，降低了TNF-α炎性介質(zhì)的分泌，