神經(jīng)病理性疼痛模型大鼠延髓腹后內(nèi)側(cè)核NF-κB及下游炎性因子表達(dá)的研究.pdf

1、研究背景：
　　 椎間盤源性疼痛是慢性腰背痛的一個(gè)主要原因，慢性腰背痛是由于椎間盤內(nèi)部結(jié)構(gòu)髓核的紊亂和纖維環(huán)出現(xiàn)裂隙，髓核漏出到外層纖維環(huán)而導(dǎo)致的。而導(dǎo)致疼痛的炎性機(jī)制越來(lái)越受到人們的重視。在炎癥機(jī)制里參與的各種細(xì)胞因子在疼痛的發(fā)生、發(fā)展中起著怎樣的作用，應(yīng)如何利用這些細(xì)胞因子來(lái)治療疼痛，引起了廣泛的研究。
　　 目前已知核轉(zhuǎn)錄因子-kappa B(NF-кB)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與調(diào)控神經(jīng)病理性疼痛中多種炎癥介質(zhì)的表達(dá)，加劇

2、炎癥反應(yīng)，引起疼痛。多種炎癥介質(zhì)受NF-кB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控，使炎性因子的表達(dá)顯著增加，如白細(xì)胞介素-6(IL-6)、一氧化氮(NO)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPS)、前列腺素-2(PGE22)、磷脂酶-2(PLA-2)等。有研究報(bào)導(dǎo)了在背根神經(jīng)節(jié)和脊髓背角處的NF-кB信號(hào)傳導(dǎo)通路在疼痛發(fā)生時(shí)被激活的情況。
　　 但這些研究均采用結(jié)扎坐骨神經(jīng)或腰神經(jīng)根的方法來(lái)構(gòu)建實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，與椎間盤源性疼痛產(chǎn)生

3、的病理生理機(jī)制不盡相同。我們模擬臨床椎間盤源性疼痛的病理形式建立了一個(gè)新的椎間盤疼痛動(dòng)物模型，并研究在該模型下研究延髓腹內(nèi)側(cè)核神經(jīng)元中NF-кB及下游炎癥介質(zhì)的變化情況。盡管Kawakami等率先采用了該模型研究自體髓核導(dǎo)致的椎間盤性疼痛，但目前僅局限于腰神經(jīng)根和背根神經(jīng)節(jié)水平。
　　 目前已知延髓頭端腹內(nèi)側(cè)核群(RVM)，它接受前額葉皮層、下丘腦、中央導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)(PAG)和臂旁核等結(jié)構(gòu)的傳入，其傳出纖維主要經(jīng)過(guò)脊髓背外側(cè)束

4、和腹外側(cè)束下行到達(dá)脊髓背角，參與疼痛通路的傳遞。在慢性疼痛狀態(tài)下，RVM被認(rèn)為參與調(diào)節(jié)下行激動(dòng)系統(tǒng)。NF-кB認(rèn)為是調(diào)節(jié)炎性因子表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄信號(hào)之一，例如在慢性炎性疼痛中刻意調(diào)節(jié)白介素6(IL-6)的表達(dá)。但對(duì)于該模型下延髓腹內(nèi)側(cè)核群的神經(jīng)元是否參與炎癥機(jī)制還缺乏深入的研究。
　　 目的：
　　 本實(shí)驗(yàn)將著眼于研究椎間盤退變引起的神經(jīng)病理性疼痛的誘因，即椎間盤退變，髓核誘發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)；產(chǎn)生疼痛時(shí)內(nèi)部的炎癥介質(zhì)表達(dá)情況

5、的變化；以及疼痛感覺(jué)傳導(dǎo)通路的中繼核團(tuán)參與調(diào)控的情況加以研究。本實(shí)驗(yàn)研究探討延髓頭端腹內(nèi)側(cè)核團(tuán)及脊髓背角中NF-кB及下游炎性因子IL-6參與疼痛的調(diào)控機(jī)制，以期尋找為神經(jīng)病理性疼痛的預(yù)防和治療提供新的方法和途徑。
　　 方法：
　　 1.神經(jīng)病理性疼痛模型的建立與分組：56只成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為兩組：手術(shù)組和假手術(shù)組，手術(shù)組取自體尾椎纖維環(huán)碎塊置于右側(cè)第4、5腰神經(jīng)根前內(nèi)側(cè)、髓核涂于表面，假手術(shù)組僅暴露神經(jīng)根，不做

6、處理。術(shù)前及術(shù)后1、4、7、14、28天分別測(cè)定雙側(cè)后肢足底的機(jī)械痛閾和熱痛閾。
　　 2.免疫組織化學(xué)(IHC)測(cè)定：心臟灌注后，取材，切片，備用。IHC測(cè)定各組組織中NF-кB和炎性因子的表達(dá)差異，應(yīng)用TJTY-400TC彩色細(xì)胞圖像分析儀對(duì)各組切片隨機(jī)抽取的20個(gè)不相互重疊的視野進(jìn)行分析，計(jì)算NF-кBp65和IL-6免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。
　　 3.Western-blot：測(cè)量痛閾完成后，處死大鼠。置于生理鹽水冰

7、塊上取出延髓節(jié)段，剪除周圍組織，保留RVM部分備用。采用UNSCAN-IT生物電泳圖像分析系統(tǒng)對(duì)Western印跡顯示的免疫反應(yīng)陽(yáng)性條帶進(jìn)行吸光度測(cè)定，以NF-kappa B和β-actin條帶的吸光度的比值代表NF-kappa B表達(dá)的相對(duì)水平。
　　 4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：用SPSS13.0分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，當(dāng)P<0.05時(shí)認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.各組痛閾的變化：術(shù)前各組大鼠機(jī)械痛閾和

8、熱痛閾值的比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。術(shù)后第1～3d，兩組大鼠的熱痛和機(jī)械痛閾值無(wú)明顯差異。手術(shù)組：患側(cè)在第4天閾值降低(P<.05)，第7天達(dá)到峰值與Sham組比較(P<.05)，7d后開(kāi)始逐漸恢復(fù)，持續(xù)到第28天(P<.05)。手術(shù)組內(nèi)同一大鼠左右側(cè)比較在術(shù)后4d、7d、14d，有顯著性差異(P<.05)。假手術(shù)組內(nèi)左右兩側(cè)術(shù)前術(shù)后痛閾的比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 2.Western-blot測(cè)定結(jié)果：手術(shù)組，NF-kappa B的表

9、達(dá)在4d開(kāi)始增高，術(shù)后第7天達(dá)到最高值，然后開(kāi)始降低，持續(xù)到28天。假手術(shù)組各時(shí)間點(diǎn)則沒(méi)有明顯變化.兩組在術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)存在顯著性差異(P<.05)。鞘內(nèi)給藥后，PDTC+手術(shù)組NF-kappa B表達(dá)量顯著降低，較未給藥組存在顯著性差異(P<.05)。
　　 3.免疫組化測(cè)定結(jié)果：假手術(shù)組陽(yáng)性細(xì)胞較少，而手術(shù)組陽(yáng)性細(xì)胞則明顯增多(P<.05)，炎癥因子IL-6也出現(xiàn)相同表達(dá)趨勢(shì)。
　　 結(jié)論：
　　 1.本