人激活素受體結(jié)合蛋白2的克隆、鑒定及其與乳腺癌相關(guān)性的研究.pdf

1、激活素（Activin）屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF—β）超家族成員的多功能生長(zhǎng)和分化因子，激活素具有多種生物學(xué)功能及廣泛的生物學(xué)活性，參與全身多種組織、細(xì)胞的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)，維持其正常功能。尤其是激活素A，對(duì)機(jī)體的整個(gè)生命過(guò)程均有重要的作用。激活素的生物學(xué)效應(yīng)與其作用的靶細(xì)胞類型有關(guān)，具有明顯的組織特異性。研究表明，激活素信號(hào)參與了乳腺細(xì)胞的生長(zhǎng)并調(diào)節(jié)乳腺的發(fā)育。而且激活素的受體和它的信號(hào)分子存在于人的乳腺癌細(xì)胞系。這些結(jié)果提示激活素的表達(dá)可

2、能與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展具有密切的相關(guān)性。 激活素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑如下：激活素與其Ⅱ型受體（ActRⅡ）結(jié)合后，Ⅱ型受體磷酸化，磷酸化的Ⅱ型受體會(huì)進(jìn)一步使受體Ⅰ磷酸化，磷酸化的受體Ⅰ進(jìn)一步使細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子Smad2/3磷酸化，磷酸化的Smad2/3會(huì)進(jìn)一步和Smad4結(jié)合，并進(jìn)入細(xì)胞核，從而調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄。在激活素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，激活素受體Ⅱ是直接和激活素結(jié)合的受體，其在膜上的表達(dá)量將直接影響激活素信號(hào)的強(qiáng)度。最近的研究結(jié)果表

3、明，小鼠激活素受體相互作用蛋白（ARIPs）可通過(guò)調(diào)控激活素受體Ⅱ在膜上的表達(dá)量來(lái)調(diào)節(jié)激活素的信號(hào)，其中小鼠的ARIP2可通過(guò)與ActRⅡ結(jié)合抑制激活素信號(hào)。但目前為止，尚無(wú)人ARIP2的相關(guān)研究報(bào)道。 本研究通過(guò)RT—PCR方法從人293細(xì)胞中釣取了人ARIP2的cDNA序列。該基因cDNA編碼區(qū)長(zhǎng)546bp，編碼一個(gè)182個(gè)氨基酸的蛋白，與小鼠ARIP2有很高的同源性，在其N末端也有一個(gè)PDZ功能區(qū)，能特異性與激活素Ⅱ型受體

4、相互作用。 本研究進(jìn)一步檢測(cè)了hARIP2對(duì)激活素信號(hào)的影響。將激活素應(yīng)答性報(bào)告載體CAGA—lux與pcDNA3—FLAG—hARIP2或pcDNA3質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞系MCF-7細(xì)胞和MDA—MB-231細(xì)胞。結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)hARIP2可以抑制激活素應(yīng)答性基因的轉(zhuǎn)錄，并且具有劑量依賴性。而通過(guò)RNA干涉方法下調(diào)hARIP2的表達(dá)，則可增強(qiáng)激活素應(yīng)答性基因的轉(zhuǎn)錄。 為了研究hARIP2對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的作用，我們分別

5、在乳腺癌細(xì)胞系MCF-7細(xì)胞和MDA—MB-231細(xì)胞中過(guò)表達(dá)hARIP2或下調(diào)hARIP2的表達(dá)，之后利用MTT法和平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了hARIP2對(duì)MCF-7細(xì)胞和MDA—MB-231細(xì)胞增殖能力的影響。結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)hARIP2能夠促進(jìn)MCF-7細(xì)胞和MDA—MB-231細(xì)胞的增殖。反之，下調(diào)hARIP2基因的表達(dá)則抑制MCF-7細(xì)胞和MDA—MB-231細(xì)胞的增殖。同時(shí)，我們也研究了hARIP2對(duì)其它腫瘤細(xì)胞的作用，發(fā)現(xiàn)過(guò)表

6、達(dá)hARIP2同樣能夠促進(jìn)其它腫瘤細(xì)胞的增殖，下調(diào)hARIP2基因的表達(dá)則抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。 另外，本研究還自行制備了hARIP2多克隆抗體。并用此抗體通過(guò)免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)了hARIP2在乳腺良性增生組織、乳腺纖維腺瘤、乳腺單純癌、乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌及乳腺黏液癌組織中的表達(dá)情況，同時(shí)分析了hARIP2的表達(dá)與腫瘤的惡性度、腫瘤大小、腫瘤病理學(xué)等級(jí)及轉(zhuǎn)移情況的關(guān)系。結(jié)果表明，hARIP2在乳腺良性增生組織及乳腺纖維腺瘤組織中不