納米鋁佐劑的制備及其輔佐HBsAg的免疫學(xué)效應(yīng)研究.pdf

1、疫苗佐劑能夠選擇性的刺激免疫應(yīng)答而提高免疫效果.鋁鹽作為疫苗佐劑已有近80年的歷史.商業(yè)疫苗中的鋁佐劑包括偏氫氧化鋁(結(jié)晶型的AlOOH,即通常所說的氫氧化鋁)和磷酸氫氧化鋁(Al(OH)x(PO4)y,即通常所說的磷酸鋁).氫氧化鋁佐劑由于高吸附能力及其對某些抗原具有較好的吸附性而優(yōu)于磷酸鋁佐劑,它也是唯一被美國FDA認(rèn)證的人用疫苗佐劑,其等電點(diǎn)iep(isoelectric point,iep)=11.4,在機(jī)體pH=7.4的間質(zhì)液

2、中帶正電荷.雖然氫氧化鋁佐劑應(yīng)用歷史悠久,但其具體作用機(jī)制不明,目前認(rèn)為主要是"儲(chǔ)存庫效應(yīng)"和"免疫刺激效應(yīng)"兩種機(jī)制.鋁佐劑吸附抗原后,在接種區(qū)域形成抗原貯存庫,一方面在該處強(qiáng)烈吸引樹突狀細(xì)胞(DC)、巨噬細(xì)胞(MΦ)等抗原提呈細(xì)胞(APC)識別與內(nèi)吞;另一方面,在注射局部緩慢釋放抗原,延長了APC與T淋巴細(xì)胞相互作用的時(shí)間,從而提高抗體應(yīng)答,增強(qiáng)體液免疫.氫氧化鋁佐劑吸附抗原,主要依賴于抗原的物理化學(xué)特性,其他吸附條件,包括pH值、

3、溫度、膠粒粒徑以及反應(yīng)混合物的離子強(qiáng)度等,影響著氫氧化鋁的吸附度.在制備過程中,這些條件常常被忽略并且很少闡明,從而影響了佐劑最佳效應(yīng)的發(fā)揮.有關(guān)膠粒粒徑影響其吸附能力的研究表明:相對于較大顆粒而言,較小顆粒具有更大的表面積,從而可吸附更多的抗原.例如,氫氧化鋁佐劑吸附白喉內(nèi)毒素的量,與其粒徑成反比.我們選擇HBsAg作為鋁佐劑吸附的模式抗原,主要考慮如下:HBsAg是由蛋白質(zhì)、糖和脂質(zhì)構(gòu)成的復(fù)雜的大分子聚集物,其分子量為3500kDa

4、,脂質(zhì)中的磷脂約占70﹪;HBsAg與氫氧化鋁的吸附不是由疏水作用、電荷吸引,而主要是HBsAg的磷酸根與氫氧化鋁佐劑的氫氧根,這兩個(gè)配基之間的交換,提供了最強(qiáng)的吸附機(jī)制;并且體內(nèi)與體外的吸附度變化不大,所受到的解吸附作用及其微小.所以,當(dāng)氫氧化鋁佐劑成為納米級顆粒吸附HBsAg時(shí),主要與急劇增大的比表面積有關(guān).又由于納米粒子具有表面反應(yīng)活性高、表面活性中心多、吸附能力強(qiáng)等這些優(yōu)異性質(zhì),從而對吸附度有較大的影響,可能會(huì)吸附更多的HBsA

5、g.納米粒子與生物體有著密切的關(guān)系,并且納米佐劑可以避免載體效應(yīng)的發(fā)生,還是巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞的首選吞噬目標(biāo).正是基于納米粒子不同于常規(guī)粒子的特性,我們采用W/O型微乳液制備納米鋁佐劑,并初步評價(jià)了其輔佐HBsAg的疫苗佐劑的生物學(xué)行為.首先,我們考察了陽離子表面活性劑(苯扎溴銨)和助表面活性劑(正辛醇)的最大飽和溶水量,即二者最佳復(fù)配的質(zhì)量比為1∶1,略大于理論值5∶8,與理論值較為符合;然后討論了最佳復(fù)配比的混合表面活性劑與油(環(huán)

6、己烷)和AlCl<,3>溶液形成微乳液體系的相行為,并繪制了擬三元相圖,W/O型微乳液區(qū)在擬三元相圖的底部.恒溫下,該區(qū)域的各組分比例即為制備納米鋁佐劑的微乳液配方.在保證產(chǎn)品為納米級的前提下,同時(shí)考慮生產(chǎn)成本,當(dāng)油相一定時(shí),溶水量越多則產(chǎn)量越多,在此條件下,確定適合作為制備反應(yīng)相的W/O型微乳液的配方,制備了納米鋁佐劑.產(chǎn)物透射電鏡(TEM)照片分析:顆粒為平均粒徑72.62nm的球形顆粒,形狀較規(guī)則、分布均勻.X射線衍射(XRD)進(jìn)

7、一步分析,XRD圖譜中峰尖的特征值主要為4.7262,4.3710,3.2019,2.2213,1.7215,1.4577,1.3317.與JCPDS卡對照,可確定本方法制備的產(chǎn)品為Al(OH)<,3>.差式量熱掃描(DSC)分析的相變溫度,較常規(guī)Al(OH)<,3>顆粒的轉(zhuǎn)變溫度有較大的提前,主要是顆粒粒徑較小的緣故,間接證明了制備產(chǎn)物為納米級.為了研究納米鋁佐劑的生物學(xué)效應(yīng),我們采用未加佐劑的HBsAg為抗原,采用ELISA測定了納

8、米鋁佐劑對疫苗的吸附能力,前者上清OD450值約為常規(guī)鋁佐劑的10倍.從免疫學(xué)觀點(diǎn)來看,最關(guān)心的是納米氫氧化鋁佐劑能否提高其對病毒抗原的免疫應(yīng)答以及對抗病毒的保護(hù)水平.我們進(jìn)一步研究了納米鋁佐劑物理吸附HBsAg后的動(dòng)物免疫效果.按1mg鋁佐劑吸附10μgHBsAg的標(biāo)準(zhǔn),配制新型的乙肝疫苗.以常規(guī)鋁佐劑為對照,皮下注射豚鼠,ELISA法檢測血清中抗體水平以測定體液免疫應(yīng)答. 納米鋁佐劑在初次免疫后的第1周和第2周可以產(chǎn)生抗-HBs抗體

9、,其GMT分別為22.974±1.3612和26.389±1.4214,而常規(guī)鋁佐劑組為2±0.073和13.195±1.1204.提示:納米鋁佐劑可以較早的刺激抗-HBs抗體的產(chǎn)生.其機(jī)制可能是初次免疫后的爆釋效應(yīng)(burst-released)所致;但其作用時(shí)間有限,而"免疫刺激效應(yīng)"是其隨后的作用機(jī)制,二者在作用時(shí)間上存在著先后關(guān)系.可能正是由于該原因,納米鋁佐劑的爆釋效應(yīng)快速作用并消失后,而免疫刺激效應(yīng)又未即時(shí)完全起效,導(dǎo)致本研

10、究中觀察到第3周的抗體滴度略有下降,而其余時(shí)間的抗體滴度相同.Balb/c小鼠雙側(cè)腹股溝皮下注射,經(jīng)1次或3次免疫后,測定細(xì)胞免疫應(yīng)答的指標(biāo),具體包括: 3H-TdR摻入法測定小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力,無論是采用皮下注射的一次免疫程序,還是皮下和腹腔注射的三次免疫程序,納米鋁佐劑組對小鼠脾淋巴細(xì)胞的刺激作用,均強(qiáng)于常規(guī)鋁佐劑組,但二者無顯著性差異.這與既往的分子免疫學(xué)研究結(jié)果相一致,即鋁佐劑主要激活Th2免疫細(xì)胞,產(chǎn)生體液免疫.用活化的小

11、鼠脾細(xì)胞測定IL-2,納米鋁佐劑組對誘導(dǎo)小鼠脾淋巴細(xì)胞上清的IL-2的作用,強(qiáng)于常規(guī)鋁佐劑組,但無顯著性差異.該結(jié)果提示:納米鋁佐劑與常規(guī)鋁佐劑在誘導(dǎo)Th細(xì)胞分化中,均不能使Th細(xì)胞向著Th1細(xì)胞免疫的方向分化,可能由于二者不能有效的促進(jìn)細(xì)胞因子IL-2的分泌.無色孔雀綠法測定腹腔巨噬細(xì)胞(pMΦ)非特異吞噬能力,小鼠腹腔注射常規(guī)鋁佐劑后,產(chǎn)生嚴(yán)重腹膜炎,而納米鋁佐劑組的腹腔炎癥反應(yīng)則輕得多.正是由于常規(guī)鋁佐劑刺激導(dǎo)致過度的炎癥反應(yīng),使

12、得大量的腹腔巨噬細(xì)胞游走、滲出,從而出現(xiàn)了皮下和腹腔注射的三次免疫程序后,納米鋁佐劑組的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的非特異吞噬能力低于常規(guī)組,但采用皮下注射的一次免疫程序則相反.該實(shí)驗(yàn)結(jié)果,不僅表明納米鋁佐劑對提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的非特異吞噬能力強(qiáng)于常規(guī)鋁佐劑,而且間接反應(yīng)了前者的毒性低于后者.該研究與曾報(bào)導(dǎo)的分子免疫學(xué)研究結(jié)果相一致,即鋁佐劑主要激活Th2免疫細(xì)胞,產(chǎn)生體液免疫.還觀察到納米鋁佐劑更易于被巨噬細(xì)胞等APC吞噬,從而更有效的激發(fā)免

13、疫應(yīng)答.我們在佐劑的安全實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn),常規(guī)鋁佐劑組的注射局部出現(xiàn)較嚴(yán)重的脫毛、可見直徑約2~3mm的皮下硬結(jié);腹腔注射的常規(guī)鋁佐劑組,小鼠出現(xiàn)較嚴(yán)重的腹膜炎,而納米鋁佐劑組的癥狀則相對較輕.提示:納米鋁佐劑對機(jī)體的毒性反應(yīng)小于常規(guī)鋁佐劑,即安全性較好. 總之,納米鋁佐劑在輔佐HBsAg疫苗的某些方面,優(yōu)于目前的常規(guī)鋁佐劑.如何將其更好地應(yīng)用于更多的疫苗,使其誘導(dǎo)出強(qiáng)大的細(xì)胞免疫,這是未來研究的關(guān)鍵問題,相信通過更深入的研究,特別是納米生