重組改構人腫瘤壞死因子協(xié)同順鉑對小鼠Lewis肺癌抑制作用及機理的研究.pdf

1、目的：肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，盡管臨床上規(guī)范化治療的實施，但肺癌患者的5年生存率仍不足20％，如何增強現(xiàn)有的抗腫瘤藥物的抗瘤作用，提高化療療效，是目前發(fā)展抗腫瘤藥物應用的研究方向之一。本研究擬通過Lewis肺癌動物實驗模型，采用生理鹽水、順鉑(cisplatin,DDP)、重組改構人腫瘤壞死因子(recombinantmutant human tumor necrosis factor,rmhTNF)及兩藥聯(lián)合進行干預，測量各

2、組動物的平均瘤重，計算抑瘤率，測定腫瘤細胞凋亡率和細胞周期以及Lewis肺癌組織內(nèi)凋亡抑制因子(Survivin)及增殖細胞核抗原(PCNA)表達水平，從而闡明重組改構人腫瘤壞死因子聯(lián)合順鉑對肺癌有協(xié)同抑制作用，并初步探討其可能發(fā)生作用的機制。 方法： 1、建立模型和實驗分組：將40只體重為19-21克健康雄性C57BL/6小鼠稱重，隨機分為4組(每組10只)：生理鹽水組(對照組)、DDP組(6.15mg/kg)、rmh

3、TNF組(150萬U/kg)以及rmhTNF(150萬U/kg)與DDP(6.15mg/kg)聯(lián)合組。將小鼠Lewis肺癌(LLC)細胞株接種于各組小鼠右上肢腋窩皮下，構建Lewis肺癌動物實驗模型。 2、抑瘤作用評價：接種后隔日檢查皮下腫瘤生長情況。接種第7天，都可捫及腫瘤，待第12天，捫及皮下腫瘤平均大小約(1.0×1.0×1.0)cm3時開始按分組分別給予瘤內(nèi)注射生理鹽水、DDP、rmhTNF、rmhTNF+DDP，每只0

4、.2mL，連續(xù)三天，停藥24小時后脫頸椎處死全部小鼠，立即剝離皮下腫瘤，稱取瘤重，計算各組平均瘤重及抑瘤率。 3、流式細胞術測定Lewis肺癌移植瘤細胞凋亡率及細胞周期。 4、免疫組化學法檢測Lewis肺癌移植瘤組織內(nèi)Survivin、PCNA表達水平，比較各組之間的差異。 5、采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測Survivin的表達，比較各組之間的差異。 6、統(tǒng)計分析：用SPSS13.0統(tǒng)計學軟

5、件進行數(shù)據(jù)處理，各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(-x±s)的形式表示。兩個獨立樣本組間均數(shù)比較用t檢驗，多組間均數(shù)差異性比較采用單因素方差分析(one-wayANOVA)。P<0.05為差異有顯著性，P<0.01為差異有極顯著性，P>0.05為差異無顯著性。 結果： 1、平均瘤重及抑瘤率：DDP組和rmhTNF組小鼠的平均瘤重分別為2.964±0.091g、3.010±0.089g較對照組的瘤重3.576±0.126g減輕(P<

6、0.05)，但兩單藥組之間無明顯差異(P>0.05)。rmhTNF+DDP組小鼠的平均瘤重為2.267±0.050g與對照組相比減輕尤為明顯(P<0.01)。而rmhTNF+DDP組的平均瘤重低于DDP組和rmhTNF組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。從抑瘤率來看，與對照組相比，DDP組、rmhTYNF組及rmhTNF+DDP組對小鼠移植瘤均有明顯的抑制作用，DDF組、rmhTNF組及rmhTNF+DDP組的抑瘤率分別為17.115

7、％、15.828％，36.605％。其中以聯(lián)合用藥組的抑瘤率最為顯著。聯(lián)合用藥的q值等于1.2，表明兩藥具有協(xié)同作用，rmhTNF具有增強DDP抑制小鼠Lewis肺癌移植瘤生長的作用。 2、流式細胞術檢測結果：與對照組相比，DDP組和rmhTNF組細胞G0/G1期比例增加，S期比例下降，增殖指數(shù)PI下降(P<0.05)；rmhTNF+DDP組測得細胞G0/G1期比例明顯增加、S期比例明顯下降，增殖指數(shù)PI明顯下降(P<0.01)

8、。而且rmhTNF+DDP組與DDP組和rmhTNF組相比G0/G1期比例增加、S期比例下降，增殖指數(shù)PI下降(P<0.05)。瘤組織經(jīng)流式細胞術檢測凋亡率結果顯示：DDP組、rmhTNF組和rmhTNF+DDP組均測得典型的亞二倍體凋亡峰，rmhTNF組、DDP組的凋亡率分別為：20.269％、21.599％，與對照組16.103％比較凋亡率逐漸升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。但兩單藥組之間無明顯差異(P>0.05)。rmhT

9、NF+DDP組腫瘤組織中癌細胞的凋亡率為28.175％較對照組升高更為明顯，有顯著性差異(P<0.01)，而rmhTNF+DDP組凋亡率高于DDP組和rmhTNF組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 3、免疫組化檢測結果：免疫組化結果顯示：rmhTNF組和DDP組腫瘤組織中PCNA陽性標記指數(shù)(Labeling index，LI)平均值分別為(40.875±3.271)％、(40.500±4.567)％均低于對照組(61.37

10、5±6.759)％，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。但兩單藥組之間無明顯差異(P>0.05)。rmhTNF+DDP組腫瘤組織中PCNA LI為(29.125±3.833)％與對照組相比降低尤為明顯(P<0.01)。而rmhTNF+DDP組的PCNA LI低于DDP組和rmhTNF組，有顯著的統(tǒng)計學意義(P<0.05)。rmhTNF組和DDP組腫瘤組織中Survivin LI平均值分別為(31.000±2.507)％、(30.375±2

11、.875)％低于對照組(43.750±4.166)％，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但兩單藥組之間無明顯差異(P>0.05)。rmhTNF+DDP組腫瘤組織中Survivin LI為(22.375±4.138)％與對照組相比有顯著的統(tǒng)計學意義(P<0.01)。而rmhTNF+DDP組的Survivin LI低于DDP組和rmhTNF組(P<0.05)。 4、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測Survivin的表達結果：r

12、mhTNF組和DDP組的SurvivinmRNA相對表達水平較對照組下降(P<0.05)。但兩單藥組之間無明顯差異(P>0.05)。rmhTNF+DDP組的小鼠腫瘤組織中Survivin mRNA表達明顯下調(diào)，較對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，而rmhTNF+DDP組的Survivin mRNA表達與rmhTNF組和DDP組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 結論： 1、本研究選用與人類肺癌極為相似的理想

13、動物模型，對肺癌的進一步研究有著重要意義。 2、重組改構人腫瘤壞死因子與順鉑聯(lián)合應用，具有協(xié)同抗腫瘤的作用，可明顯抑制小鼠Lewis肺癌移植瘤的生長，改變細胞周期的分布，使腫瘤細胞周期阻滯于G0/G1期，抑制腫瘤細胞的增殖、誘導腫瘤細胞凋亡。 3、DDP組、rmhTNF組及rmhTNF+DDP組均可下調(diào)小鼠Lewis肺癌移植瘤Survivin和PCNA蛋白表達水平，但rmhTNF+DDP組對Survivin和PCNA蛋白

14、表達的影響更為顯著。 4、rmhTNF+DDP組對小鼠Lewis肺癌移植瘤生長有明顯抑制作用，并顯著下調(diào)小鼠Lewis肺癌移植瘤的Survivin和PCNA蛋白表達水平。據(jù)此可推測，其發(fā)生的可能機制是：一是聯(lián)合組可通過抑制PCNA蛋白的表達，減低DNA聚合酶的活性，干擾腫瘤細胞DNA的合成，從而抑制腫瘤細胞的增殖。一是聯(lián)合組通過抑制凋亡抑制蛋白Survivin基因的表達水平，使Caspase介導的凋亡信號傳導途徑激活，達到促凋亡