注射用重組改構(gòu)人腫瘤壞死因子治療人胃癌主要藥效學及作用機制.pdf

1、目的：注射用重組改構(gòu)人腫瘤壞死因子(RecombinantMutant Human Tumor Necrosis Factor for injection，rmh-TNF NC)，是用PCR(聚合酶鏈式反應)技術(shù)，以原型腫瘤壞死因子的cDNA為模版，改造TNF基因，由151個氨基酸組成的非糖基化多肽單鏈，分子量為16598道爾頓。這一改構(gòu)擴大了TNF-α的療效范圍，增強了其抗腫瘤的活性，提高了TNF-α結(jié)合的效率，獲得了高活性、低毒性的

2、新型重組改構(gòu)人腫瘤壞死因子，簡稱rmh-TNF。rmh-TNF屬于天然TNF-α的改構(gòu)體，具有與天然TNF相似的生物學活性，它不僅有效殺傷多種腫瘤細胞，而且對正常細胞(受體選擇性)無細胞毒作用，且具有較明顯的化療增敏作用。rmh-TNF是新近進入臨床的國家一類新藥，主要臨床適應癥是晚期非小細胞肺癌和非霍奇金氏淋巴瘤，尚未見對于消化道腫瘤尤其是胃癌的實驗研究報道。目前胃癌仍然是世界第二位癌癥死亡原因和第四位高發(fā)的癌癥，每年約有650000

3、死亡病例和880000新增病例，幾乎有2/3是發(fā)生在發(fā)展中國家。本研究目的是通過檢測人胃癌細胞BGC-823和人臍靜脈內(nèi)皮細胞HUVEC-12增殖和凋亡情況，及血管形成能力、克隆形成能力和遷移能力的變化，及對人胃癌裸鼠移植瘤模型的治療作用，研究rmh-TNF治療人胃癌方面主要藥效學，并通過蛋白印跡法和免疫共沉淀初步探究其作用機制。
　　 方法：體外培養(yǎng)人胃癌細胞BGC-823和人臍靜脈內(nèi)皮細胞HUVEC-12，分別用不同濃度rm

4、h-TNF和TNF-α處理，并設對照組。MTT檢測細胞增殖情況，Annexin V-FITC/PI和TUNEL法檢測細胞凋亡情況。流式細胞儀分析細胞的周期分布和凋亡率。小管形成實驗檢測HUVWEC-12血管生成能力的變化。軟瓊脂克隆形成實驗及劃痕法檢測BGC-823克隆形成能力和遷移能力的變化。建立人胃癌裸鼠皮下移植瘤模型，分為rmh-TNF、TNF-α及陽性對照(5-Fu)和陰性對照(生理鹽水)組進行治療性實驗，繪制移植瘤生長曲線，計

5、算瘤質(zhì)量抑制率，觀察其對皮下成瘤能力的影響，觀察生存時間和生命延長率，一般情況及解剖學變化，HE染色觀察腫瘤組織病理改變，CD34免疫組化檢測腫瘤組織內(nèi)微血管密度(MVD)。蛋白質(zhì)印跡法檢測BGC-823細胞中Procaspase-3，Bcl-2和Bax的表達情況。免疫共沉淀檢測rmh-TNF與DR5間是否有相互作用。
　　 結(jié)果：MTT結(jié)果顯示rmh-TNF能抑制BGC-823細胞和HUVEC-12細胞增殖，呈現(xiàn)良好的時效關(guān)系

6、和量效關(guān)系，其IC50值約為TNF-α的1/2-3/4，差異有顯著性(P<0.05)。Annexin V-FITC/PI及TUNEL實驗結(jié)果均表明rmh-TNF有誘導細胞凋亡的作用，呈劑量依賴性。rmh-TNF和TNF-α處理后兩種細胞周期分析均出現(xiàn)S期細胞增多而G0/G1期和G2/M期細胞減少，凋亡率增高，且呈現(xiàn)劑量依賴性。小管形成實驗顯示rmh-TNF對血管形成有抑制作用，軟瓊脂克隆形成實驗和劃痕法證實rmh-TNF對BGC-823

7、細胞的克隆形成及遷移能力有抑制作用。皮下移植瘤模型構(gòu)建成功，腫瘤生長曲線顯示rmh-TNF組瘤體生長明顯受到抑制，rmh-TNF組瘤質(zhì)量抑制率為83.13％。rmh-TNF組，TNF-α組和陽性對照組生命延長率分別為85.18％，62.34％，及59.88％，陰性對照組荷瘤裸鼠一般情況明顯較治療組和陽性對照組差，各組裸鼠解剖學檢查均未發(fā)現(xiàn)除移植瘤以外的其它器官、系統(tǒng)病變。HE染色病理組織學檢查發(fā)現(xiàn)實驗組和陽性對照組腫瘤組織有明顯的凋亡和

8、壞死形成，癌細胞的異型性明顯減小，CD34免疫組化顯示MVD明顯減小，其中rmh-TNF組較其他各組減小更為明顯(P<0.05)。蛋白印跡法發(fā)現(xiàn)BGC-823細胞中rmh-TNF組較對照組中Procaspase-3和Bax的表達明顯上調(diào)，而Bcl-2的表達明顯下調(diào)，且有劑量依賴性。免疫共沉淀證實rmh-TNF和DR5間存在相互作用。
　　 結(jié)論：1.rmh-TNF對于體外培養(yǎng)的人胃癌細胞BGC-823和人臍靜脈內(nèi)皮細胞HUVEC

9、-12具有抑制增殖，誘導凋亡的作用，且較TNF-α更明顯，差異有顯著性(P<0.05)；2.rmh-TNF能抑制HUVEC-12的血管生成能力和BGC-823的克隆形成能力，且較TNF-α更明顯，差異有顯著性(P<0.05)，對BGC-823的遷移能力有抑制作用；3.人胃癌細胞BGC-823在BALB/c-裸鼠皮下有良好的成瘤性；4.rmh-TNF對人胃癌細胞BGC-823 BALB/c裸鼠皮下移植瘤模型有治療作用，能抑制皮下移植瘤生長

10、，延長荷瘤裸鼠生存時間，且較TNF-α更明顯，差異有顯著性(P<0.05)；5.rmh-TNF能夠?qū)е氯宋赴┘毎鸅GC-823BALB/c裸鼠皮下移植瘤出現(xiàn)凋亡和壞死，并對移植瘤中的血管生成有抑制作用，且較TNF-α更明顯，差異有顯著性(P<0.05)；6.rmh-TNF可能通過使Procaspase-3表達上調(diào)并裂解激活，并使Bcl-2表達下調(diào)，Bax表達上調(diào)，Bax/Bcl-2值上升，從而發(fā)揮其促凋亡作用；7.rmh-TNF可能通過