OPG在腹主動(dòng)脈瘤中的表達(dá)及OPG與主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡關(guān)系研究.pdf

1、目的：
　　 檢測OPG(骨保護(hù)素)在不同直徑大小人腹主動(dòng)脈瘤(AAA)組織中的表達(dá)情況，探討其在腹主動(dòng)脈瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用。
　　 方法：
　　 (1)應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測20例AAA組織(包括6例小腹主動(dòng)脈瘤(SAAA)：橫徑4.0～5.5cm，6例中腹主動(dòng)脈瘤(MAAA)：橫徑5.5～7.0cm，4例大腹主動(dòng)脈瘤(LAAA)：橫徑≥7.0cm，4例破裂型腹主動(dòng)脈瘤(RAAA)和對(duì)照組6例正常腹主動(dòng)脈

2、組織OPG的表達(dá)。
　　 (2)Western-blooting和RT—PCR技術(shù)檢測不同直徑大小瘤體中OPG，MMP-9蛋白及mRNA表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：
　　 (1)與正常腹主動(dòng)脈對(duì)照，AAA組織中OPG的陽性細(xì)胞明顯增多，主要分布于中膜，并與炎性細(xì)胞浸潤程度呈顯著正相關(guān)，AAA組中OPG的表達(dá)明顯高于對(duì)照組，差異具有顯著性(P<0.05)。
　　 (2) OPG的蛋白及mRNA表達(dá)在AAA組明顯

3、高于正常腹主動(dòng)脈，差異具有顯著性(P<0.05)，且與MMP-9表達(dá)及瘤體直徑呈顯著正相關(guān)。
　　 結(jié)論：OPG水平與AAA有關(guān)，OPG可能通過促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)和炎癥細(xì)胞浸潤，在基質(zhì)和細(xì)胞水平參與腹主動(dòng)脈結(jié)構(gòu)損傷與重構(gòu)，促進(jìn)AAA形成和發(fā)展。
　　 目的觀察兔體內(nèi)主動(dòng)脈壁剪切力變化情況下動(dòng)脈成瘤的形態(tài)學(xué)變化及OPG的表達(dá)情況及其與中膜血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)密度降低的關(guān)系。
　　 方法取新西蘭兔共24

4、只，在腎動(dòng)脈平面以下2cm將供體的一段腹主動(dòng)脈壁作補(bǔ)片移植到受體腹主動(dòng)脈而成瘤，分別在術(shù)后7，21，35天獲取瘤體及腹主動(dòng)脈組織標(biāo)本，分別測量術(shù)前及成瘤后腹主動(dòng)脈的形態(tài)學(xué)參數(shù)，免疫組織化學(xué)法檢測OPG抗原的表達(dá)，半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT—PCR)檢測OPG、MMP-9的mRNA表達(dá)，Westernblot檢測OPG、MMP-9的蛋白產(chǎn)物表達(dá)，原位末端DNA標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)測定中膜VSMCs凋亡的變化；計(jì)算機(jī)圖像分析并計(jì)算VS

5、MCs密度及平均光密度。
　　 結(jié)果實(shí)驗(yàn)組兔存活15只，腹主動(dòng)脈血流通暢，無吻合口狹窄，實(shí)驗(yàn)組腹主動(dòng)脈直徑隨時(shí)間延長逐漸擴(kuò)張，與對(duì)照組有顯著差異(P<0.05)；HE染色顯示明顯增生的內(nèi)外膜存在大量免疫炎性細(xì)胞浸潤，中膜明顯變薄，平滑肌細(xì)胞排列紊亂，密度明顯降低。特殊染色可見中膜彈力蛋白明顯纖細(xì)，僵硬，平滑肌層明顯變薄，計(jì)算機(jī)圖像進(jìn)一步分析顯示，瘤體內(nèi)外徑隨時(shí)間延長逐步增加，彈力蛋白、膠原纖維含量與外徑呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05

6、)；免疫組織化學(xué)染色顯示實(shí)驗(yàn)組OPG表達(dá)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，且表達(dá)水平與瘤體大小成正比。Western免疫印跡及RT—PCR結(jié)果顯示OPG、MMP-9的蛋白及mRNA表達(dá)呈陽性，且隨瘤體直徑擴(kuò)大而表達(dá)逐漸增強(qiáng)，而正常對(duì)照組無明顯的陽性條帶。TUNEL檢測發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組凋亡細(xì)胞明顯高于對(duì)照組，其中陽性VSMCs凋亡占35％以上，與瘤體外徑呈顯著正相關(guān)。
　　 結(jié)論1血管補(bǔ)片法構(gòu)建的AAA是一種穩(wěn)定可靠的動(dòng)物模型，適用于A

7、AA發(fā)病機(jī)制及防治的體內(nèi)研究。
　　 2動(dòng)脈壁剪切力變化可以引起局部OPG，MMP-9表達(dá)增加及VSMCs凋亡增加。
　　 3 OPG表達(dá)與VSMCs凋亡具有相關(guān)性，可能對(duì)動(dòng)脈瘤形成起著一定的作用。
　　 目的：利用OPG基因過表達(dá)及RNA干擾技術(shù)作用于人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)，觀察VSMCs凋亡的情況。
　　 方法：①實(shí)驗(yàn)材料：購買OPG基因，同時(shí)體外化學(xué)合成4條OPG序列特異性小干擾RNA

8、(small interfering RNA，siRNA)。②實(shí)驗(yàn)方法：將購買的OPG基因亞克隆至穿梭載體上，同時(shí)隨機(jī)選擇一條shRNA，構(gòu)建shRNA真核表達(dá)載體，包裝腺病毒，轉(zhuǎn)染人主動(dòng)脈VSMCs。③實(shí)驗(yàn)分組：分為空白組、OPG過表達(dá)組、OPG過表達(dá)+RNA干擾組。④實(shí)驗(yàn)評(píng)估：應(yīng)用RT—PCR，Western blot檢測OPG基因表達(dá)的變化；應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測VSMCs凋亡情況。
　　 結(jié)果：①空白細(xì)胞組中，OPG表達(dá)量比