我國(guó)狂犬病流行毒株馴化及高效佐劑疫苗研究.pdf

1、在我國(guó),每年被犬咬傷的人數(shù)多達(dá)1千萬(wàn)以上,并因此導(dǎo)致至少2000～3000人死于狂犬病。國(guó)產(chǎn)滅活疫苗發(fā)展緩慢是我國(guó)人狂犬病持續(xù)多發(fā)的原因之一。我國(guó)犬的狂犬病疫苗產(chǎn)品供應(yīng)多年來(lái)一直依賴少量進(jìn)口滅活疫苗和國(guó)產(chǎn)弱毒活疫苗。目前,進(jìn)口疫苗供應(yīng)量只能占總需求量的1～3％,弱毒疫苗由于安全性問(wèn)題在發(fā)達(dá)國(guó)家早已不再用于家畜動(dòng)物免疫,少數(shù)幾家國(guó)產(chǎn)滅活疫苗產(chǎn)品雖然在近幾年已完成注冊(cè),但由于效力和成本等各種原因遲遲未能上市或剛剛啟動(dòng)生產(chǎn),而且產(chǎn)能有限,其數(shù)

2、量和質(zhì)量遠(yuǎn)不能保證有效免疫的高覆蓋率。因此,提高細(xì)胞培養(yǎng)狂犬病病毒的產(chǎn)毒滴度和研制高效疫苗佐劑,是我國(guó)動(dòng)物狂犬病滅活疫苗研究的兩個(gè)主要方向,也是解決疫苗效力和生產(chǎn)成本問(wèn)題的重要途徑。
　　針對(duì)上述問(wèn)題,本研究開(kāi)展了以下試驗(yàn):
　　1.我國(guó)狂犬病病毒流行毒株的細(xì)胞馴化。試驗(yàn)內(nèi)容:①毒株的細(xì)胞培養(yǎng)。對(duì)分離自我國(guó)江西地區(qū)的一株鼬獾狂犬病病毒JX08-45株在BHK-21細(xì)胞上進(jìn)行連續(xù)傳代和培養(yǎng)滴度(TCID50)測(cè)定。②病毒細(xì)胞適

3、應(yīng)株的致病性檢測(cè)。以腦內(nèi)和肌肉注射途徑,分別在犬和小鼠進(jìn)行病毒致病性檢測(cè)。③全基因組測(cè)序分析。對(duì)病毒適應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)前后的全基因組核苷酸和氨基酸變化進(jìn)行分析,并與其他疫苗株和流行株進(jìn)行比對(duì),從而確定影響病毒細(xì)胞適性的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)。④免疫原性檢測(cè)。通過(guò)小鼠免疫試驗(yàn),對(duì)該細(xì)胞適應(yīng)株和其他疫苗株的滅活后免疫原性進(jìn)行比較,評(píng)價(jià)本毒株的免疫原性。
　　2.狂犬病疫苗佐劑的研制。試驗(yàn)內(nèi)容:①新型佐劑和免疫增強(qiáng)劑的篩選。進(jìn)行一系列佐劑的制備,利用

4、小鼠免疫試驗(yàn)和狂犬病中和抗體滴度測(cè)定,對(duì)佐劑的免疫增強(qiáng)作用進(jìn)行檢測(cè),篩選出適用于狂犬病滅活疫苗的高效佐劑。②佐劑的作用機(jī)制研究。通過(guò)淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)、血液Th/Tc細(xì)胞亞群鑒定和細(xì)胞因子檢測(cè),對(duì)佐劑誘導(dǎo)的免疫類型及增強(qiáng)抗體反應(yīng)的機(jī)制進(jìn)行研究。③佐劑的安全性評(píng)價(jià)。通過(guò)超劑量接種,檢測(cè)小鼠的生長(zhǎng)發(fā)育和生育能力變化,以及內(nèi)臟組織的病理學(xué)變化。
　　3.高效佐劑狂犬病疫苗的研制。試驗(yàn)內(nèi)容:①疫苗的制備。通過(guò)在小鼠和犬的免疫效果評(píng)價(jià),確定病

5、毒的最佳培養(yǎng)工藝和佐劑/抗原的最佳配比,并進(jìn)行三批實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)品的制備。②疫苗的安全性評(píng)價(jià)。通過(guò)在犬的超劑量免疫,檢測(cè)疫苗對(duì)犬內(nèi)臟組織、體溫、行為和飲食的影響。③與國(guó)內(nèi)同類疫苗產(chǎn)品免疫效果的比較。通過(guò)在犬的免疫試驗(yàn),對(duì)國(guó)內(nèi)使用的進(jìn)口疫苗和本疫苗誘導(dǎo)的體液免疫水平進(jìn)行檢測(cè)和比較。④疫苗效力檢測(cè)方法的建立。利用狂犬病中和抗體標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法(FAVN法),建立適用于本疫苗效力檢驗(yàn)的小鼠血清學(xué)疫苗效力測(cè)定方法,并對(duì)其檢測(cè)的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性進(jìn)行驗(yàn)證。<

6、br>　　通過(guò)以上試驗(yàn),獲得以下結(jié)果:
　　1.細(xì)胞馴化結(jié)果顯示,病毒在BHK-21傳至120代時(shí)增殖滴度能達(dá)到108.0TCID50/mL,并將其重新命名為JX08-45CC株。JX08-45CC株腦內(nèi)接種可使小鼠100%致死,外周攻毒僅能使部分小鼠死亡,但外周接種對(duì)犬不致病。JX08-45CC適應(yīng)細(xì)胞后基因組中共發(fā)生了17個(gè)核苷酸位點(diǎn)的突變和7個(gè)氨基酸突變,其中6個(gè)氨基酸突變點(diǎn)在G蛋白,但并未改變其中和抗原表位和主要的毒力相關(guān)

7、位點(diǎn)。6個(gè)G蛋白氨基酸突變點(diǎn)中,有4個(gè)位點(diǎn)與其他疫苗株序列一致,其中2個(gè)位點(diǎn)與流行株序列不同。JX08-45CC株滅活后的免疫原性與國(guó)內(nèi)使用的疫苗株相比,在相同病毒滴度下不低于現(xiàn)有疫苗株。
　　2.免疫佐劑的制備研究結(jié)果顯示,以水包油型佐劑和黃芪多糖為佐劑的疫苗,能誘導(dǎo)產(chǎn)生顯著高于普通氫氧化鋁佐劑疫苗的狂犬病中和抗體,而且多糖能加速疫苗誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答。佐劑接種對(duì)小鼠發(fā)育和生育能力無(wú)明顯影響,對(duì)小鼠主要內(nèi)臟未造成損傷。水包油型佐

8、劑和黃芪多糖均可刺激淋巴細(xì)胞明顯增殖,能誘導(dǎo)血液中Th1/Tc1細(xì)胞亞群的極化和多種細(xì)胞因子(IL-1β、IL-5、IL-6、MCP-1、GM-CSF和IFN-α)水平上調(diào),主要通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞免疫增強(qiáng)機(jī)體的抗體反應(yīng)水平。
　　3.高效佐劑疫苗研究結(jié)果顯示,病毒的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)條件:5%同步接種,37℃培養(yǎng)4h,34℃培養(yǎng)7～8天;并確定疫苗配制體積比(佐劑:病毒液)為1:4,黃芪多糖在疫苗的工作濃度為10mg/mL。根據(jù)以上確定的疫苗配制

9、方案,完成了3批實(shí)驗(yàn)室狂犬病滅活疫苗(JX08-45CC株)制備(批號(hào):201001Vac、201002Vac和201003Vac),疫苗效力分別為3.15IU/mL、3.10IU/mL和3.05IU/mL。本疫苗對(duì)犬生長(zhǎng)發(fā)育和主要臟器均無(wú)明顯影響。本疫苗在犬誘導(dǎo)的抗體水平總體高于目前國(guó)內(nèi)使用的進(jìn)口疫苗,對(duì)攻毒犬具有完全保護(hù)能力。根據(jù)疫苗生產(chǎn)需要,建立了一種快速、簡(jiǎn)便的半定量檢測(cè)疫苗效力的小鼠血清學(xué)方法,具有周期短、成本低、重復(fù)性好的特

10、點(diǎn),適用于生產(chǎn)中疫苗效力檢驗(yàn)。
　　通過(guò)以上結(jié)果,得出以下結(jié)論:
　　1.獲得一株適應(yīng)BHK-21細(xì)胞高滴度培養(yǎng)的狂犬病病毒JX08-45CC株,其致病性和基因組序列變化等背景清楚,免疫原性強(qiáng),具備疫苗候選株的基本條件。
　　2.制備了兩種用于狂犬病滅活疫苗的佐劑,闡明了佐劑通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞免疫增強(qiáng)體液免疫的基本作用機(jī)制,并證明其免疫增強(qiáng)作用顯著、安全性良好,制備工藝簡(jiǎn)單,適用于獸用狂犬病疫苗生產(chǎn)。
　　3.利用馴化

11、毒株和兩種佐劑研制了狂犬病滅活疫苗(JX08-45CC株),其制備工藝簡(jiǎn)單、效力檢驗(yàn)方法簡(jiǎn)便、生產(chǎn)成本低廉、安全性良好、免疫效力較高,符合我國(guó)犬狂犬病免疫的現(xiàn)實(shí)需求。
　　論文創(chuàng)新點(diǎn):
　　1.為我國(guó)獸用疫苗生產(chǎn)獲得了第一個(gè)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)、培養(yǎng)滴度高、免疫原性好的狂犬病疫苗候選株。
　　2.研制出用于狂犬病滅活疫苗的新型佐劑,闡明了其基本作用機(jī)制,并證明具有顯著免疫增強(qiáng)作用,適用于狂犬病滅活疫苗生產(chǎn)。
　　3.