地西他濱對(duì)小鼠淋巴瘤細(xì)胞免疫原性的增強(qiáng)作用及機(jī)制探索.pdf

1、地西他濱(Decitabine，DAC)作為一種新型去甲基化藥物，主要用于骨髓異常增生綜合征(Myelodysplastic Syndrome，MDS)及急性髓系白血病(AcuteMyeloid Leukemia，AML)的治療。研究發(fā)現(xiàn)DAC可以上調(diào)許多免疫相關(guān)的分子，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫原性，在白血病患者的治療中發(fā)現(xiàn)，去甲基化藥物可以誘導(dǎo)產(chǎn)生腫瘤特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(Cytotoxic Lymphoctye，CTL)，人們推測(cè)去甲基化

2、藥物具有增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)的作用。我們選取小鼠T淋巴瘤/淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞EL4，建立小鼠淋巴瘤模型，研究DAC對(duì)EL4細(xì)胞免疫原性的增強(qiáng)作用并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行探索。
　　 1.地西他濱誘導(dǎo)小鼠淋巴瘤細(xì)胞EL4凋亡
　　 我們用不同濃度的DAC體外處理EL4細(xì)胞，通過(guò)CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況，發(fā)現(xiàn)DAC對(duì)EL4細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用具有濃度依賴性，0.25μM時(shí)，有30％的增殖抑制作用。此時(shí)，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了明顯變化，呈現(xiàn)出

3、一種不典型的凋亡狀態(tài)，且在體內(nèi)成瘤性也明顯下降。經(jīng)過(guò)Amaexin-V/PI雙染后，流式檢測(cè)發(fā)現(xiàn)DAC濃度越高，細(xì)胞凋亡越明顯，且以早期凋亡為主。
　　 2.地西他濱上調(diào)CD80分子
　　 基因表達(dá)譜芯片篩查結(jié)果顯示，DAC處理后EL4細(xì)胞腫瘤相關(guān)抗原和CD分子(Cluster of Differentiation)的表達(dá)都上調(diào)了，其中CD80表達(dá)的上調(diào)很明顯。我們利用PCR技術(shù)和流式細(xì)胞儀檢測(cè)，證實(shí)DAC上調(diào)EL4細(xì)胞

4、CD80在mRNA和蛋白水平的表達(dá)，上調(diào)狀態(tài)在體外能夠持續(xù)30天左右。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)DAC體內(nèi)治療也能夠上調(diào)EL4細(xì)胞CD80的表達(dá)量。通過(guò)對(duì)EL4細(xì)胞CD80啟動(dòng)子區(qū)甲基化測(cè)序，我們發(fā)現(xiàn)CD80的表達(dá)跟DNA甲基化關(guān)系密切。
　　 3.地西他濱上調(diào)CD80強(qiáng)化抗腫瘤免疫反應(yīng)
　　 在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)DAC能夠抑制EL4細(xì)胞的成瘤性。通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，DAC治療后腫瘤內(nèi)T細(xì)胞侵潤(rùn)明顯增多。胞內(nèi)細(xì)胞因子染色結(jié)果表明

5、：T細(xì)胞IL-2和IFN-γ的分泌量也明顯增加。利用抗-CD8和抗-CD4單克隆抗體建立淋巴瘤小鼠CD8+T細(xì)胞或CD4+T體內(nèi)清除模型，發(fā)現(xiàn)DAC治療后CD8+T參與了抗腫瘤反應(yīng)。
　　 混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)DAC處理后的EL4細(xì)胞能夠有效刺激淋巴細(xì)胞增殖，刺激T細(xì)胞分泌IL-2和IFN-γ，當(dāng)CD80被阻斷后，其對(duì)淋巴細(xì)胞的刺激能力下降。通過(guò)流式分選技術(shù)從DAC處理后的EL4細(xì)胞中分選出CD80+和CD80-細(xì)胞群，對(duì)小鼠進(jìn)

6、行接種，發(fā)現(xiàn)CD80+組小鼠腫瘤生長(zhǎng)明顯緩慢，且部分腫瘤會(huì)停止生長(zhǎng)并縮小，流式分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD80+組腫瘤中T細(xì)胞和NK細(xì)胞的侵潤(rùn)都顯著高于CD80-組，說(shuō)明DAC誘導(dǎo)CD80上調(diào)，增強(qiáng)腫瘤免疫原性，強(qiáng)化了抗腫瘤免疫反應(yīng)。
　　 綜上，我們的研究發(fā)現(xiàn)DAC可以誘導(dǎo)EL4細(xì)胞表達(dá)多種免疫相關(guān)分子，增強(qiáng)其免疫原性，其中CD80起重要的作用，并首次發(fā)現(xiàn)CD80表達(dá)跟DNA甲基化的關(guān)系，豐富了免疫調(diào)節(jié)受表觀調(diào)控的內(nèi)容，為去甲基化藥物增強(qiáng)