補(bǔ)腎活血方對(duì)膝關(guān)節(jié)假體周?chē)俏占癛ANKL-RANK-OPG通路的干預(yù)研究.pdf

1、研究目的:
　　近年來(lái)，隨著我國(guó)人口壽命的大幅提高，我國(guó)社會(huì)亦逐步步入老齡化社會(huì)，在此背景下，老年性疾病發(fā)病率逐步升高，體現(xiàn)在骨科方面即是退行性疾病及骨質(zhì)疏松性疾病的發(fā)病率逐年升高，而膝OA（骨關(guān)節(jié)炎）則是目前退行性骨關(guān)節(jié)炎里面的最常見(jiàn)疾病，而隨著我國(guó)醫(yī)療技術(shù)水平的日益提高及社會(huì)健康觀念的日益提升，老年人追求良好生活質(zhì)量的愿望較以前更加強(qiáng)烈，因此，愿意接受人工膝關(guān)節(jié)表面置換術(shù)人治療膝OA的人數(shù)大幅增加，因此人工膝關(guān)節(jié)表面置換術(shù)已成

2、為目前臨床常見(jiàn)、重要及廣泛的治療手段，尤其是終末期膝OA的常用手段之一，而伴隨著此術(shù)式的大量應(yīng)用，膝關(guān)節(jié)假體的周?chē)侨芙鈱?dǎo)致松動(dòng)的病例數(shù)量大幅增加，二次手術(shù)不但增加了患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)及痛苦，同時(shí)亦帶來(lái)了巨大的醫(yī)療風(fēng)險(xiǎn)。目前膝關(guān)節(jié)假體周?chē)侨芙獾目赡苄暂^多，存在低毒性感染、應(yīng)力機(jī)制及微粒機(jī)制等多種可能，而對(duì)應(yīng)后兩種機(jī)制，目前西醫(yī)藥防治骨溶解主要以抗骨質(zhì)疏松治療，調(diào)節(jié)骨代謝為主，依據(jù)骨質(zhì)疏松研究中骨代謝機(jī)制使用調(diào)節(jié)骨代謝藥物并取得一定的效果，

3、近二十年，中醫(yī)中藥的抗骨質(zhì)疏松研究無(wú)論在基礎(chǔ)研究和臨床研究上均做了大量工作，并取得了部分成果，但目前在中醫(yī)藥防治人工假體骨溶解方面尚存在大量空白，相關(guān)研究較欠缺，把中醫(yī)中藥在抗骨質(zhì)疏松方面所研究的成果運(yùn)用在膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后的骨量丟失方面目前還是空白，故本人嘗試通過(guò)研究補(bǔ)腎強(qiáng)筋膠囊干預(yù)人工膝關(guān)節(jié)表面假體周?chē)俏?，并通過(guò)假體周?chē)敲芏?、OPG、RANKL的變化及實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物研究等證明其是否具有作用并初步闡明其相關(guān)機(jī)制。
　　研究方法:<

4、br>　　臨床部分以膝骨關(guān)節(jié)炎并行膝關(guān)節(jié)表面置換術(shù)患者在研究對(duì)象，實(shí)驗(yàn)部分采用小鼠通過(guò)植入PMMA微粒進(jìn)行造顱骨板骨吸收模型，通過(guò)檢測(cè)補(bǔ)腎活血方治療后各組血清OPG、RANKL蛋白濃度及顱骨OPG、RANKLmRNA表達(dá)，來(lái)揭示不同劑量的補(bǔ)腎活血方與OPG、RANKL變化的關(guān)系，并嘗試解釋補(bǔ)腎活血方與OPG、RANKL的關(guān)系，是否具有相關(guān)性，具體相關(guān)性如何。
　　一、臨床觀察研究
　　選取我院2013年2月-2014年2月廣

5、東省第二中醫(yī)院骨科病房的膝骨關(guān)節(jié)炎并行膝關(guān)節(jié)表面置換術(shù)后患者，證型符合者納入;西醫(yī)的診斷嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行，所有受試對(duì)象均需簽署知情同意書(shū)。試驗(yàn)組27例，對(duì)照組25例，采用隨機(jī)雙盲對(duì)照研究，兩組均行單膝人工關(guān)節(jié)表面置換術(shù)，均采用LINK公司PS型假體行膝關(guān)節(jié)置換手術(shù)治療，所有假體均用骨水泥固定，所有患者術(shù)后均采用相同的康復(fù)方法，并于術(shù)后分期進(jìn)行HSS評(píng)分。對(duì)照組行人工膝關(guān)節(jié)置換術(shù)，術(shù)后口服鈣爾奇D0.6g/次，2次/日，連續(xù)服用26周;試

6、驗(yàn)組除執(zhí)行手術(shù)治療外，尚口服我院院內(nèi)制劑補(bǔ)腎強(qiáng)筋膠囊，1粒/次，3次/天，連續(xù)服用26周，股骨假體周?chē)譃?個(gè)興趣區(qū)，分別為ROI14，脛骨假體周?chē)譃?個(gè)興趣區(qū)，分別為RoI1-3，應(yīng)用雙能X線骨密度儀對(duì)各個(gè)區(qū)內(nèi)的骨密度變化進(jìn)行觀察，兩組患者術(shù)后1周、3月、6月、12月的HSS評(píng)分，應(yīng)用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　二、臨床試驗(yàn)研究
　　入組患者于清晨空腹抽取靜脈血，離心處理后OPG、RANKL的測(cè)定均采用ELISA

7、法測(cè)定，分別測(cè)定術(shù)前、術(shù)后2周、3月、6月數(shù)值并記錄分析。膝關(guān)節(jié)置換手術(shù)治療，采用德國(guó)LINK公司PS型假體，所有假體均用骨水泥固定，所有患者術(shù)后均采用大致相同的康復(fù)方法，并于12個(gè)月隨訪時(shí)進(jìn)行HSS評(píng)分。股骨假體周?chē)譃?個(gè)興趣區(qū)，分別為ROI1-4，脛骨假體周?chē)譃?個(gè)興趣區(qū)，分別為RoI1-3，應(yīng)用雙能X線骨密度儀對(duì)各個(gè)區(qū)內(nèi)的骨密度變化進(jìn)行觀察，應(yīng)用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　三、實(shí)驗(yàn)研究
　　選取實(shí)驗(yàn)雄性小鼠

8、造模，采用小鼠40只，分為五組，第1組為空白組（假手術(shù)組），第2組為造模組模型組，第3組為補(bǔ)腎強(qiáng)筋膠囊低劑量組，第4組為補(bǔ)腎強(qiáng)筋膠囊中劑量組，第5組為補(bǔ)腎強(qiáng)筋膠囊高劑量組，第1組采取假手術(shù)處理，2、3、4、5組均自顱項(xiàng)切開(kāi)后將PMMA顆粒溶液均勻涂抹于顱骨板上，分別予低、中、高劑量灌胃，正常飲食，處死后取顱骨組織，觀察并計(jì)算顱骨陷窩面積，提取顱骨中央骨組織總DNA采用PCR法行mRNA表達(dá)檢測(cè)分析，并行Western blotting法

9、檢測(cè)骨組織OPG、RANKL蛋白表達(dá)。
　　研究結(jié)果:
　　一、臨床觀察研究
　　（一）HSS評(píng)分:
　　結(jié)果顯示:所有患者經(jīng)過(guò)12個(gè)月隨訪，隨訪期間患者均無(wú)感染、假體松動(dòng)的情況發(fā)生，4例患者有輕微的膝部疼痛，但不影響活動(dòng)。HSS評(píng)分:術(shù)后1周試驗(yàn)組平均分48.44分，對(duì)照組48.41分，兩組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，術(shù)后3月試驗(yàn)組平均得分67.96分，對(duì)照組63.72分，兩組有顯著差異(P＜0.01);術(shù)后

10、6月試驗(yàn)組平均得分80.78分，對(duì)照組76.08分，兩組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);術(shù)后12月試驗(yàn)組平均得分84.00分，對(duì)照組82.64分，兩組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;兩組術(shù)前與術(shù)后1周評(píng)分比較，均有顯著性差異(P＜0.01);兩組術(shù)后6月及12月分別前后比較，試驗(yàn)組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，對(duì)照組有顯著性差異(P＜0.01)。
　　（二）骨密度觀察研究
　　1.ROI1區(qū)兩組平均骨密度
　　試驗(yàn)組:與術(shù)后1周比較，術(shù)

11、后1年平均骨密度減少20.32％(P＜0.01);與術(shù)后1周比較，術(shù)后3月平均骨密度減少11.05％(P＜0.01);與術(shù)后3月比較，術(shù)后6月平均骨密度下降無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);與術(shù)后6月比較，術(shù)后1年平均骨密度下降無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　對(duì)照組:與術(shù)后1周比較，術(shù)后1年平均骨密度減少26.26％(P＜0.01);與術(shù)后1周比較，術(shù)后3月平均骨密度減少11.01％(P＜0.05);與術(shù)后3月比較，術(shù)后6月平均骨

12、密度下降，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，較術(shù)后1周下降23.73％(P＜0.01);與術(shù)后6月比較，術(shù)后1年平均骨密度下降無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　兩組術(shù)后1周平均骨密度比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);兩組術(shù)后1年平均骨密度比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2.ROI2區(qū)兩組平均骨密度
　　試驗(yàn)組:與術(shù)后1周比較，術(shù)后1年平均骨密度減少19.30％(P＜0.01);與術(shù)后1周比較，術(shù)后

13、3月平均骨密度減少10.31％((P＜0.01));與術(shù)后3月比較，術(shù)后6月平均骨密度下降無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);與術(shù)后6月比較，術(shù)后1年平均骨密度下降無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　對(duì)照組:與術(shù)后1周比較，術(shù)后1年平均骨密度減少25.18％(P＜0.01);與術(shù)后1周比較，術(shù)后3月平均骨密度減少9.96％(P＜0.01);與術(shù)后3月比較，術(shù)后6月平均骨密度下降，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，較術(shù)后1周下降18.33％

14、(P＜0.01);與術(shù)后6月比較，術(shù)后1年平均骨密度下降無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　兩組術(shù)后1周平均骨密度比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);兩組術(shù)后1年平均骨密度比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3.ROI3區(qū)兩組平均骨密度
　　試驗(yàn)組:與術(shù)后1周比較，術(shù)后1年平均骨密度減少12.28％(P＜0.01);與術(shù)后1周比較，術(shù)后3月平均骨密度減少9.43％(P＜0.01)，術(shù)后6月平均骨密度減少

15、11.33％(P＜0.01)。
　　對(duì)照組:與術(shù)后1周比較，術(shù)后1年平均骨密度減少12.30％(P＜0.01);與術(shù)后1周比較，術(shù)后3月平均骨密度減少9.41％(P＜0.05)，術(shù)后6月平均骨密度減少10.33％(P＜0.01)。
　　兩組術(shù)后1周平均骨密度比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);兩組術(shù)后1年平均骨密度比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　4.ROI4區(qū)兩組平均骨密度
　　試驗(yàn)組:與術(shù)后1

16、周比較，術(shù)后1年平均骨密度減少12.85％(P＜0.01);與術(shù)后1周比較，術(shù)后3月平均骨密度減少5.41％(P＜0.05)，術(shù)后6月平均骨密度減少9.56％(P＜0.01)。
　　對(duì)照組:與術(shù)后1周比較，術(shù)后1年平均骨密度減少14.43％(P＜0.01);與術(shù)后1周比較，術(shù)后3月平均骨密度減少5.52％(P＜0.05)，術(shù)后6月平均骨密度減少9.46％(P＜0.05)。
　　兩組術(shù)后1周平均骨密度比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

17、＞0.05);兩組術(shù)后1年平均骨密度比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)
　　5.ROI5區(qū)兩組平均骨密度
　　試驗(yàn)組:與術(shù)后1周比較，術(shù)后1年平均骨密度減少21.08％(P＜0.01);與術(shù)后1周比較，術(shù)后3月平均骨密度減少11.32％(P＜0.05)，術(shù)后6月平均骨密度減少17.51％(P＜0.05)。
　　對(duì)照組:與術(shù)后1周比較，術(shù)后1年平均骨密度減少23.68％(P＜0.01);與術(shù)后1周比較，術(shù)后3月平均骨

18、密度減少10.92％(P＜0.05)，術(shù)后6月平均骨密度減少17.69％(P＜0.01)。
　　兩組術(shù)后1周平均骨密度比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);兩組術(shù)后1年平均骨密度比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05).
　　6.ROI6區(qū)兩組平均骨密度
　　試驗(yàn)組:與術(shù)后1周比較，術(shù)后1年平均骨密度減少14.57％(P＜0.01);與術(shù)后1周比較，術(shù)后3月平均骨密度減少8.29％(P＜0.05)，術(shù)后6月平均骨密度減

19、少13.53％(P＜0.01)。
　　對(duì)照組:與術(shù)后1周比較，術(shù)后1年平均骨密度減少13.17％(P＜0.01);與術(shù)后1周比較，術(shù)后3月平均骨密度減少7.92％(P＜0.01)，術(shù)后6月平均骨密度減少11.63％(P＜0.01)。
　　兩組術(shù)后1周平均骨密度比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);兩組術(shù)后1年平均骨密度比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05).
　　7.ROI7區(qū)兩組平均骨密度
　　試驗(yàn)組:與術(shù)后

20、1周比較，術(shù)后1年平均骨密度減少11.25％(P＜0.01);與術(shù)后1周比較，術(shù)后3月平均骨密度減少5.90％(P＜0.05)，術(shù)后6月平均骨密度減少9.39％(P＜0.01)。
　　對(duì)照組:與術(shù)后1周比較，術(shù)后1年平均骨密度減少11.24％(P＜0.01);與術(shù)后1周比較，術(shù)后3月平均骨密度減少5.85％(P＜0.01)，術(shù)后6月平均骨密度減少9.37％(P＜0.01)。
　　兩組術(shù)后1周平均骨密度比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

21、P＞0.05);兩組術(shù)后1年平均骨密度比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　8.術(shù)后3月、6月、12月股骨、脛骨密度變化
　　術(shù)后3月:試驗(yàn)組股骨遠(yuǎn)端假體周?chē)敲芏认陆德史謩e為11.05％、10.31％、9.43％、5.41％，平均下降9.05％，對(duì)照組股骨遠(yuǎn)端假體分別為11.01％、9.96％、9.41％、5.52％，平均下降8.98％;試驗(yàn)組脛骨假體周?chē)敲芏认陆德史謩e為11.32％、8.29％、5.90％，平均

22、下降8.50％，對(duì)照組脛骨假體周?chē)敲芏认陆德史謩e為10.92％、7.92％、5.85％，平均下降8.23％。
　　術(shù)后6月:試驗(yàn)組股骨遠(yuǎn)端假體周?chē)敲芏认陆德史謩e為18.64％、13.66％、11.33％、9.56％，平均下降12.85％，對(duì)照組分別為23.74％、18.33％、10.33％、9.46％，平均下降15.47％;試驗(yàn)組脛骨假體周?chē)敲芏认陆德史謩e為17.51％、13.53％、9.39％，平均下降13.48，對(duì)照組為

23、17.69％、11.63％、9.37％，平均下降12.90％。
　　術(shù)后12月:試驗(yàn)組股骨遠(yuǎn)端假體周?chē)敲芏认陆德史謩e為20.32％、19.30％、12.28％、12.85％，平均下降16.19％，對(duì)照組股骨遠(yuǎn)端假體分別為26.26％、25.18％、12.30％、14.43％，平均下降19.54％;試驗(yàn)組脛骨假體周?chē)敲芏认陆德史謩e為21.08％、14.57％、11.25％，平均下降15.63％，對(duì)照組脛骨假體周?chē)敲芏认陆德史謩e

24、為23.68％、13.17％、11.24％，平均下降16.03％。
　　二、臨床試驗(yàn)研究:
　?。ㄒ唬㎡PG結(jié)果顯示:
　　兩組術(shù)前及術(shù)后3月比較，兩組數(shù)值相當(dāng)(P＞0.05)，兩組同組間術(shù)前及術(shù)后3月比較，兩組數(shù)值均高于術(shù)前(P＜0.01);術(shù)后6月兩組比較，試驗(yàn)組數(shù)值高于術(shù)前(P＜0.05)，試驗(yàn)組術(shù)后6月與術(shù)后3月數(shù)值比較，低于術(shù)后3月(P＜0.05);對(duì)照組術(shù)后6月與術(shù)后3月比較，兩組數(shù)值相當(dāng)(P＞0.05)。

25、
　　（二）RANKL結(jié)果顯示:
　　RANKL兩組術(shù)前及術(shù)后3月比較，兩組數(shù)值相當(dāng)(P＞0.05)，兩組同組間術(shù)前與術(shù)后3月數(shù)值比較，術(shù)后3月均大于術(shù)前(P＜0.05);術(shù)后3月兩組數(shù)值相當(dāng)(P＞0.05);術(shù)后6月兩組間數(shù)值比較，對(duì)照組高于試驗(yàn)組(P＜0.05)。
　?。ㄈ㎡PG/RANKL比值結(jié)果顯示:
　　兩組術(shù)前比較，比值相當(dāng)(P＞0.05);兩組術(shù)后3月比較，比值相當(dāng)(P＞0.05);兩組術(shù)后6月比

26、值比較，試驗(yàn)組高于對(duì)照組(P＜0.05)。
　　三、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究
　　顱骨陷窩觀察和面積計(jì)算:空白組（假手術(shù)組）小鼠鹵蓋骨骨質(zhì)結(jié)構(gòu)正常，未見(jiàn)明顯骨溶解及骨破壞，模型組與低劑量組、中劑量組面積相當(dāng)(P＞0.05)，高劑量組面積最小(p＜0.01)。
　　PCR顯示:OPG:與空白組比較，各組mRNA的表達(dá)水平均不同程度降低(P＜0.05);模型組與低劑量組mRNA的表達(dá)水平相當(dāng)(P＞0.05);高劑量組OPGmRNA的表

27、達(dá)水平與中劑量組相當(dāng)(P＞0.05);高劑量組與低劑量濃度組比較，OPG mRNA的表達(dá)水平升高(P＜0.05)。RANKL:與空白組比較，各組mRNA表達(dá)水平均不同程度升高(P＜0.05)，模型組mRNA與低劑量組、中劑量組mRNA表達(dá)水平相當(dāng)(P＞0.05);高劑量組mRNA表達(dá)水平低于中劑量組(P＜0.05)。
　　Western-blot結(jié)果顯示:OPG結(jié)果顯示:與空白組比較，各組蛋白表達(dá)水平均不同程度降低(P＜0.05)

28、;高濃度組與中濃度組比較，蛋白表達(dá)水平相當(dāng)(P＞0.05);與低劑量組比較，中劑量組表達(dá)水平升高(P＜0.05)。RANKL結(jié)果顯示:與空白組比較，各組蛋白表達(dá)水平均不同程度升高(P＜0.05)，模型組與低劑量組、中劑量組蛋白表達(dá)水平相當(dāng)(P＞0.05);高劑量組蛋白表達(dá)水平低于中劑量組(P＜0.05)。
　　研究結(jié)論:
　　1.補(bǔ)腎活血方在臨床療效研究中可明顯改善試驗(yàn)組ROI1區(qū)、ROI2區(qū)的骨密度下降及骨量丟失，證明補(bǔ)腎

29、活血方雖然不能阻止膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后周?chē)橇康膩G失，但能夠一定程度上減少骨丟失量，有利于改善膝關(guān)節(jié)術(shù)后假體周?chē)俏粘潭取?br>　　2.補(bǔ)腎活血方可以改善人工膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后功能及癥狀;
　　3.補(bǔ)腎活血方可有效改善肝腎不足，筋脈瘀滯癥候;
　　4.補(bǔ)腎活血方可以提高血清OPG濃度及升高OPG/RANKL值;
　　5.高劑量的補(bǔ)腎活血方可顯著提高骨溶解模型小鼠的顱骨OPG蛋白表達(dá)及mRNA表達(dá)水平，抑制RANKL蛋白表達(dá)及