GlyRS上游激酶的鑒定及GlyRS激酶活性的研究.pdf

1、乳蛋白合成的機(jī)理作為泌乳生物學(xué)領(lǐng)域的基礎(chǔ)科學(xué)問(wèn)題之一受到廣泛的關(guān)注，目前在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上調(diào)控乳蛋白合成的信號(hào)通路已經(jīng)被眾所周知，但是還有一些細(xì)致的生化調(diào)控機(jī)制還有待于我們進(jìn)一步研究。實(shí)驗(yàn)室的前期結(jié)果表明，甘氨酰tRNA合成酶(GlyRS)的544位蘇氨酸(T544)和704位絲氨酸(S704)處存在磷酸化現(xiàn)象，并從細(xì)胞漿進(jìn)入細(xì)胞核，結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子NFκB1的同時(shí)促進(jìn)NFκB1與β-酪蛋白（β-casein，CSN2）啟動(dòng)子結(jié)合，上調(diào)CS

2、N2的表達(dá)來(lái)調(diào)控乳蛋白合成。我們推測(cè)p-GlyRS可能作為一種新的Ser/Thr蛋白激酶直接激活NFκB1。另外實(shí)驗(yàn)室前期成果GlyRS的胞漿相互作用蛋白質(zhì)組表明幾種Ser/Thr蛋白激酶可能是介導(dǎo)氨基酸信號(hào)激活GlyRS磷酸化的上游激酶。本研究擬利用體外激酶活性研究方法闡明GlyRS是否直接激活NFκB1以及鑒定GlyRS的上游激酶，以深入揭示GlyRS介導(dǎo)氨基酸信號(hào)通過(guò)激活NFκB1從而促進(jìn)乳蛋白合成的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用的分子機(jī)制。

3、>　　本研究對(duì)原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞(BMECs)進(jìn)行體外培養(yǎng)并純化，應(yīng)用蛋白質(zhì)免疫印記(WB)和免疫熒光(IF)的方法鑒定了BMECs的純度和泌乳功能。本實(shí)驗(yàn)首先對(duì)GlyRS的上游激酶進(jìn)行了探究。在GlyRS的Co-IP質(zhì)譜中發(fā)現(xiàn)了與其相結(jié)合的蛋白激酶p-MAP3K10，利用Co-IP方法驗(yàn)證了在細(xì)胞內(nèi)p-MAP3K10與GlyRS存在相互作用，隨后進(jìn)行了體外激酶實(shí)驗(yàn)。GST-GlyRS經(jīng)E.coli BL21原核誘導(dǎo)表達(dá)，并進(jìn)一步經(jīng)G

4、ST親和柱純化得到GST-GlyRS作為底物，同時(shí)利用Co-IP富集了p-MAP3K10，進(jìn)行體外激酶實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示GlyRS在T544和S704處都發(fā)生了磷酸化，但分子質(zhì)量在80 kDa-100 kDa之間，推測(cè)可能在進(jìn)行體外激酶反應(yīng)過(guò)程中同時(shí)發(fā)生了降解或剪切。因此進(jìn)一步進(jìn)行了p-MAP3K10在6個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)激活GlyRS的體外激酶反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明在p-MAP3K10激活GST-GlyRS的過(guò)程中確實(shí)出現(xiàn)截短形式的p-GlyRS。

5、以上結(jié)果表明p-MAP3K10激活GST-GlyRS使其2個(gè)磷酸化位點(diǎn)被磷酸化，確定p-MAP3K10為GlyRS的上游激酶。
　　實(shí)驗(yàn)室前期工作已確定p-GlyRS與NFκB1在體內(nèi)存在直接相互作用，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)以確定p-GlyRS是否能將NFκB1直接激活。經(jīng)原核誘導(dǎo)并純化得到GST-NFκB1作為底物，與富集的p-GlyRS進(jìn)行體外激酶實(shí)驗(yàn)，同時(shí)將GlyRS與NFκB1的體外激酶實(shí)驗(yàn)作為對(duì)照。結(jié)果顯示GlyRS與NFκB1的對(duì)

6、照組并沒有出現(xiàn)p-NFκB1，而在p-GlyRS與NFκB1實(shí)驗(yàn)組，在目的蛋白132 kDa處出現(xiàn)p-NFκB1。為進(jìn)一步確定p-GlyRS對(duì)NFκB1的直接激活作用，設(shè)計(jì)了p-MAP3K10、GST-GlyRS、GST-NFκB1的連續(xù)激活的體外激酶實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示只有在連續(xù)激活組出現(xiàn)了目的蛋白的明顯條帶，其他對(duì)照組并未產(chǎn)生p-NFκB1，提示p-NFκB1的產(chǎn)生是由一系列的激活作用完成的。
　　為了給予更直接的p-GlyRS激活

7、NFκB1的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，我們選擇利用純化的p-GlyRS進(jìn)行體外激酶反應(yīng)實(shí)驗(yàn)。構(gòu)建pCMV-C-Flag-GlyRS真核表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，提取胞核蛋白，利用Flag純化試劑盒和磷酸化試劑盒進(jìn)行連續(xù)純化，得到純化產(chǎn)物為單一的磷酸化蛋白，western blotting鑒定為p-GlyRS。利用純化后的p-GlyRS蛋白與GST-NFκB1進(jìn)行體外激酶實(shí)驗(yàn)，應(yīng)用anti-phospho-Ser/Thr/Tyr抗體經(jīng)western bl

8、otting檢測(cè)磷酸化蛋白，并利用Flag抗體檢測(cè)pCMV-C-Flag-GlyRS表達(dá)產(chǎn)物，結(jié)果顯示在目的分子質(zhì)量處出現(xiàn)p-NFκB1。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明GlyRS具有激酶活性。利用生物信息學(xué)分析比較了GlyRS與Ser/Thr激酶的催化結(jié)構(gòu)域的相似序列，發(fā)現(xiàn)Ser/Thr激酶結(jié)構(gòu)域的顯著特征也存在于GlyRS中，進(jìn)一步提高了GlyRS可能具有Ser/Thr蛋白激酶活性的可能性。
　　綜上所述，p-MAP3K10使GlyRS在T5