MiRNA-181通過(guò)靶向IFn-γ調(diào)控T細(xì)胞功能在移植物抗宿主病發(fā)生中的機(jī)制研究.pdf

1、本文對(duì)MiRNA-181通過(guò)靶向IFN-γ調(diào)控T細(xì)胞功能在移植物抗宿主病發(fā)生中的機(jī)制進(jìn)行了研究。本研究分為三個(gè)部分：
　　第一部分：T細(xì)胞功能相關(guān)的候選miRNAs以及細(xì)胞因子在異基因造血干細(xì)胞移植患者中的差異性表達(dá)的分析。
　　目的：探討異基因造血干細(xì)胞移植術(shù)(allo-HSCT)后伴有及不伴有急性移植物抗宿主病(aGVHD)的患者外周血CD4+T細(xì)胞及血漿中8個(gè)候選miRNAs的差異性表達(dá)情況及相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)情況分析。

2、
　　方法：8個(gè)待選miRNAs差異性表達(dá)分析:選擇健康志愿者作為對(duì)照，并參照aGVHD評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，選擇異基因造血干細(xì)胞移植術(shù)后100天內(nèi)無(wú)aGVHD以及發(fā)生Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ度aGVHD的患者，通過(guò)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)不同實(shí)驗(yàn)組外周血CD4+T淋巴細(xì)胞和血漿中8個(gè)待選的miRNAs的差異性表達(dá)情況。通過(guò)細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒分析不同實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞因子差異性表達(dá)。
　　結(jié)果：與對(duì)照組相比，在aGVHD組有4個(gè)miRNAs出現(xiàn)了差異性表達(dá)，其

3、中，miR-150和miR-181a明顯下調(diào)（P＜0.05），miR-155和miR-92b明顯上調(diào)（P＜0.05）;而miR-17，miR-92a，miR-146a以及miR-146b的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）;患者血漿中miRNAs的表達(dá)水平和上述淋巴細(xì)胞中的表達(dá)情況一致的。此外，通過(guò)ELISA檢測(cè)不同實(shí)驗(yàn)組血漿中細(xì)胞因子的表達(dá)差異，在aGVHD患者中，IL-2、IFN-γ、TNF和IL-17A的分泌水平明顯上調(diào)（P＜0

4、.05），其中IL-2，IFN-γ，TNF與aGVHD的程度呈正相關(guān)。IL-10和IL-4的分泌水平明顯下調(diào)(P＜0.05)，其中IL-10與aGVHD輕重程度呈負(fù)相關(guān)性;而IL-6的分泌水平未見(jiàn)明顯變化;在未發(fā)生aGVHD患者組中，IL-2、IFN-γ和TNF分泌水平明顯下調(diào)（P＜0.05），而IL-10、IL-4、IL-17A和IL-6的分泌水平未見(jiàn)明顯變化（P＞0.05），aGVHD發(fā)生之前各細(xì)胞因子水平均未見(jiàn)明顯變化（P＞0.0

5、5）。在發(fā)生aGVHD患者中，miR-181a和miR-150的表達(dá)水平明顯下調(diào)，并且和aGVHD的嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），miR-155的表達(dá)水平明顯上調(diào)，并且和aGVHD的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)(P＜0.05)，miR-92b的表達(dá)水平則明顯上調(diào)(P＜0.05)。此外，在GVHD發(fā)生≥4前，miR-181a，miR-150，miR-155以及miR-92b的表達(dá)水平已經(jīng)開(kāi)始明顯改變。
　　結(jié)論：miR-181a，miR-1

6、50，miR-155和miR-92b在aGVHD發(fā)生中存在差異性表達(dá);Th1免疫應(yīng)答是導(dǎo)致aGVHD發(fā)生的主要效應(yīng)機(jī)制，miRNAs和細(xì)胞因子的表達(dá)水平與aGVHD的發(fā)生程度均有相關(guān)性;差異性表達(dá)的miRNAs可以用于預(yù)測(cè)aGVHD的發(fā)生。
　　第二部分：mi R-181a對(duì)CD4+T淋巴細(xì)胞功能影響、作用機(jī)制的體外研究及靶基因的篩選、鑒定。
　　目的：對(duì)候選miRNAs進(jìn)行的靶基因預(yù)測(cè)、篩選和鑒定;探討miRNA對(duì)CD4+

7、T淋巴細(xì)胞功能影響及其可能的作用機(jī)制。
　　方法：通過(guò)生物信息學(xué)分析，篩選miRNA潛在的靶基因，通過(guò)qRT-PCR、Western blot及熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)確定候選miRNAs的靶基因。通過(guò)三質(zhì)粒系統(tǒng)進(jìn)行慢病毒包裝，構(gòu)建表達(dá)miRNA前體的慢病毒（LV-miRNA）及空載體(LV-Ctrl)，感染正常人初始CD4+T細(xì)胞，實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)miRNA在CD4+T細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量;通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)IFN-γ、IL-17

8、A、IL-4以及Foxp3進(jìn)行檢測(cè)，以評(píng)價(jià)各亞群細(xì)胞的比例;通過(guò)CCK-8及AnnexinⅤ/7-AAD檢測(cè)細(xì)胞的增殖及凋亡情況，ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子分泌的情況;此外，通過(guò)制備過(guò)表達(dá)miR-181a的慢病毒載體，以不同的病毒滴度感染一定數(shù)量的CD4+T細(xì)胞，然后評(píng)價(jià)IFN-γ的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：通過(guò)生物信息學(xué)分析篩選miR-181a的潛在的19個(gè)靶基因，其中包括IFN-γ在內(nèi)的5個(gè)靶基因是明顯下調(diào)的;熒光素酶報(bào)

9、告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)，感染miR-181a后，IFN-γ-WT的熒光活性明顯減低而IFN-γ-mu無(wú)明顯改變。進(jìn)一步通過(guò)CD4+T細(xì)胞過(guò)表達(dá)miR-181a后IFN-γ的基因mRNA水平未見(jiàn)明顯變化，而蛋白水平較空白對(duì)照組及空載體對(duì)照組明顯下降，且其水平與miR-181a的水平呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05);成功構(gòu)建了表達(dá)miR-181a前體的慢病毒載體并感染CD4+T細(xì)胞，miR-181a表達(dá)量升高約4倍（P＜0.05）;通過(guò)流式對(duì)T細(xì)胞亞群分析

10、提示，相較于對(duì)照組，LV-181a組Th1細(xì)胞比例明顯減少，Th2及Treg細(xì)胞比例增高，Th17無(wú)明顯變化;CCK-8檢測(cè)顯示LV-miR-181a組細(xì)胞增殖活性減低（P＜0.05），AnnexinⅤ/7-AAD檢測(cè)顯示LV-miR-181a組凋亡細(xì)胞比例增加(P＜0.05)。ELISA顯示LV-miR-181a組細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ及IL-17A分泌減少(P＜0.05)、IL-4分泌顯著增加（P＜0.05）;此外，隨著miR-1

11、81a濃度的遞增，IFN-γ的mRNA水平無(wú)差異性變化，但是通過(guò)對(duì)IFN-γ的蛋白水平檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水平遞減，與miR-181a濃度呈負(fù)相關(guān)。
　　結(jié)論：MiR-181a通過(guò)靶向IFN-γ調(diào)控CD4+T淋巴細(xì)胞功能;miR-181a對(duì)CD4+T淋巴細(xì)胞的功能調(diào)控具有濃度依賴(lài)性。
　　第三部分：miR-181b在小鼠異基因造血干細(xì)胞移植模型中，對(duì)急性移植物抗宿主病發(fā)生的影響。
　　目的：探討miRNA在小鼠體內(nèi)對(duì)急性移

12、植物抗宿主病發(fā)生的作用。
　　方法：通過(guò)qRT-PCR、Western blot及熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)確定在小鼠體內(nèi)相應(yīng)miRNAs對(duì)靶基因的靶向作用。獲取轉(zhuǎn)染LV-miR-181b的供鼠脾臟淋巴細(xì)胞和骨髓細(xì)胞，分別以尾靜脈注射LV-miR-181b、LV-Ctrl和PRIM1640培養(yǎng)基的C57BL/6小鼠為供鼠，qRT-PCR檢測(cè)供鼠脾臟及骨髓細(xì)胞中miR-181b的表達(dá);建立異基因造血干細(xì)胞移植模型，以BALB/c小鼠為受鼠

13、，分別取各種供鼠脾臟及骨髓單個(gè)核細(xì)胞尾靜脈注射入受鼠，行異基因造血干細(xì)胞移植，觀察移植后各組小鼠生活狀態(tài)、體重變化并監(jiān)測(cè)造血重建情況，參照aGVHD臨床評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)各組小鼠aGVHD發(fā)生情況進(jìn)行綜合評(píng)分，對(duì)小鼠肝臟、小腸等臟器進(jìn)行病理學(xué)檢測(cè)，參照aGVHD病理學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分，通過(guò)ELISA技術(shù)及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同實(shí)驗(yàn)組小鼠血漿中細(xì)胞因子及脾細(xì)胞Th細(xì)胞亞群的變化。
　　結(jié)果：通過(guò)GeneBank等數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，我們發(fā)現(xiàn)miR-18

14、1a在人、鼠中同源，其成熟序列相同，qRT-PCR結(jié)果顯示，與尾靜脈注射LV-Ctrl和PRIM1640培養(yǎng)基供鼠相比，注射LV-miR-181a的供鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞miR-181a的表達(dá)量升高約2.48倍（P＜0.05），骨髓單個(gè)核細(xì)胞miR-181a的表達(dá)無(wú)明顯變化。移植后，供鼠尾靜脈注射miR-181a（即LV-miR-181a移植組）的受鼠體內(nèi)IFN-γ mRNA的蛋白及基因水平均未見(jiàn)明顯改變，通過(guò)進(jìn)一步的熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證

15、實(shí)，在小鼠體內(nèi)miR-181a對(duì)IFN-γ不產(chǎn)生作用。進(jìn)一步的生物信息學(xué)分析及熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)在小鼠內(nèi)miR-181b和miR-181d而非miR-181a和miR-181c靶向IFN-γ的3'UTR。在小鼠體內(nèi)過(guò)表達(dá)miR-181b后，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot技術(shù)分別檢測(cè)IFN-γ的表達(dá)水平，結(jié)果提示IFN-γ的蛋白水平明顯下降(P＜0.05)而基因水平未見(jiàn)明顯改變（P＞0.05），證實(shí)了在小鼠體內(nèi)，是mi

16、R-181b靶向小鼠IFN-γ基因;在小鼠移植模型中，細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果提示，相比較于TBI組，GVHD組的Th1細(xì)胞的數(shù)量明顯增高(P＜0.05)，而IFN-γ，IL-2和TNF的水平明顯增加（P＜0.05），相同的時(shí)間點(diǎn)miR-181b變化提前于aGVHD的發(fā)生;鼠內(nèi)過(guò)表達(dá)miR-181b可以減少Th1細(xì)胞應(yīng)答并阻止aGVHD發(fā)生:在小鼠體內(nèi)過(guò)表達(dá)miR-181b后，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)其表達(dá)升高約4倍，并且miR-181b過(guò)表達(dá)組aG