重組人Kringle 5和溶血磷脂酸（LPA）在眼表炎癥性疾病中的作用.pdf

1、眼表疾病是一組臨床常見(jiàn)病，其中角膜新生血管(Comeal neovascularization,CNV)是各種致病因素所引起的嚴(yán)重眼表并發(fā)癥，是最常見(jiàn)、治療最棘手的致盲性眼病之一。不但嚴(yán)重影響視力，而且也是同種異體角膜移植術(shù)后發(fā)生排斥反應(yīng)的高危因素。至今，CNV的發(fā)病機(jī)理尚未明確，治療上也沒(méi)有理想的方法。因此，人們一直在研究角膜新生血管生成的發(fā)病機(jī)制和能阻止角膜新生血管生成的抑制劑。近年來(lái)，隨著對(duì)腫瘤和眼部新生血管的深入研究，在角膜新生

2、血管抑制劑方面的研究已取得了迅猛發(fā)展，發(fā)現(xiàn)了許多角膜新生血管形成抑制劑。Kringle5(K5蛋白)是一種新型有效的血管生成抑制因子，是血漿纖溶酶原的一種蛋白水解片段，由約80個(gè)氨基酸殘基組成。體外細(xì)胞培養(yǎng)顯示，K5蛋白可以明顯抑制人血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和移行，誘導(dǎo)增殖中的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡或引起細(xì)胞周期停滯，其抑制效果是血管生成抑制素的50倍。在正常氧及低氧條件下，重組人K5蛋白對(duì)人原代視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖呈現(xiàn)一種劑量依賴性的抑制作用；

3、玻璃體腔內(nèi)注射K5蛋白可預(yù)防或阻滯缺血性視網(wǎng)膜新生血管的進(jìn)展。但其對(duì)CNV的作用及其機(jī)制國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究首次將重組人K5蛋白配成不同濃度的滴眼液，用于堿燒傷誘導(dǎo)的兔角膜新生血管模型，采用裂隙燈顯微鏡、組織病理學(xué)檢查觀察其對(duì)CNV的抑制情況。 近年來(lái)，分子水平的研究已取得較大進(jìn)展，認(rèn)為血管生成抑制因子與刺激因子所產(chǎn)生的生物網(wǎng)絡(luò)平衡在調(diào)節(jié)血管生成中起重要作用。角膜新生血管的形成不僅要求上調(diào)新生血管刺激因子(如：血管內(nèi)皮

4、細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF))，而且同時(shí)下調(diào)新生血管抑制因子(如：血管生成抑制素)。內(nèi)源性的新生血管抑制劑對(duì)于維持角膜的無(wú)血管狀態(tài)起著尤其重要的作用。在有些病理狀態(tài)下，如角膜移植或化學(xué)損傷，角膜的某些部位可提高新生血管刺激因子的產(chǎn)生，并降低新生血管抑制因子的產(chǎn)生，從而打破了新生血管的平衡，導(dǎo)致毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞過(guò)度增殖，最終引起NV。已發(fā)現(xiàn)一些與眼部NV有關(guān)的刺激因子和抑制因子。VEGF是高度選擇性的血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂原，可調(diào)節(jié)血管滲透性(

5、血管滲透因子)，在炎癥性小鼠CNV中起重要的作用。 NV的形成是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，包括內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，遷移，基底膜的降解，和血管腔的形成。在局部生長(zhǎng)因子的控制下，微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增生是NV形成的關(guān)鍵步驟，為研究K5蛋白抗CNV的分子機(jī)制，我們將K5蛋白用于原代培養(yǎng)的新生小牛胸主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(BAEC)，新生小牛胸主動(dòng)脈血管成纖維細(xì)胞(BAFC)，血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)，檢測(cè)K5蛋白對(duì)細(xì)胞增殖的影響，并采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)K5

6、對(duì)細(xì)胞周期的影響，同時(shí)我們還采用電子顯微鏡檢查，DNA片段分析，和TUNEL方法，在體和離體檢測(cè)K5對(duì)BAEC凋亡的影響，從結(jié)構(gòu)上深入研究K5的作用機(jī)制。 炎癥反應(yīng)貫穿眼表面疾病的整個(gè)過(guò)程，是常見(jiàn)的病理現(xiàn)象。溶血磷脂酸(LPA)是一重要的脂質(zhì)介質(zhì)，它通過(guò)激活G蛋白偶聯(lián)受體產(chǎn)生廣泛的生物學(xué)作用，其作用可分為生長(zhǎng)相關(guān)的(如：增殖，抗凋亡)和細(xì)胞骨架相關(guān)的(如：集合，粘付，收縮，分泌，趨化性)。LPA也參與一些生理病理過(guò)程如炎癥反應(yīng)。

7、LPA參與中性粒細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，極化，及新陳代謝，并且可誘導(dǎo)人類單核細(xì)胞的遷移。研究發(fā)現(xiàn)一些脂源性介質(zhì)，如血小板激活因子(PAF)，涉及眼部免疫和炎癥反應(yīng)的啟動(dòng)，延續(xù)和維持，但是，LPA的生理作用及其受體在眼表炎癥中的作用尚不明確。 在本研究中，我們假設(shè)LPA在人角膜上皮細(xì)胞中充當(dāng)炎癥介質(zhì)的角色。利用已建立的細(xì)胞株作為模型系統(tǒng)，檢測(cè)LPA的產(chǎn)生，LPA及炎癥因子的信號(hào)反應(yīng)，及LPA受體拮抗劑的作用。另外，我們還著重研究K5蛋白與LP

8、A在眼表面炎癥反應(yīng)中的關(guān)系。我們檢測(cè)K5蛋白對(duì)LPA的產(chǎn)生，LPA誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖，及LPA誘導(dǎo)的與細(xì)胞增殖和炎癥有關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響。 論文主要包括以下三個(gè)部分： 第1章重組人Kringle 5(K5蛋白)滴眼液對(duì)堿燒傷 誘導(dǎo)的兔角膜新生血管的治療作用及機(jī)制 1.1 重組人K5蛋白滴眼液對(duì)角膜新生血管的作用 1.1.1堿燒傷誘導(dǎo)的單眼角膜新生血管(CNV)動(dòng)物模型的建立

9、 堿燒傷后角膜中央迅速出現(xiàn)一邊界清楚的渾濁區(qū)，PBS沖洗后渾濁加重，變?yōu)榇砂咨?。傷?2小時(shí)角膜緣新生血管芽長(zhǎng)入角膜，并向中央移行；第2周新生血管生長(zhǎng)旺盛，長(zhǎng)入燒灼斑：第3周，達(dá)角膜中央?yún)^(qū)；第28天血管布滿整個(gè)角膜。HE染色可見(jiàn)新生血管自角膜緣長(zhǎng)入燒傷區(qū)，伴大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。 1.1.2 K5蛋白滴眼液對(duì)CNV的抑制作用 K5蛋白滴眼液對(duì)CNV的抑制作用表現(xiàn)在10和20mg/L治療組延遲了CNV的出現(xiàn)時(shí)間并降低了CN

10、V的長(zhǎng)度和面積，而5mg/L組則無(wú)明顯變化。這些結(jié)果表示K5蛋白對(duì)CNV的抑制作用呈劑量依賴性。 1.1.3 K5蛋白滴眼液對(duì)CNV退化的作用 在我們的動(dòng)物模型中，傷后2周CNV形成，此時(shí)應(yīng)用K5蛋白滴眼液可明顯促進(jìn)CNV的退化。 1.1.4 K5蛋白滴眼液的抗炎癥作用 Wilcoxon秩和檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上，10和20mg/L K5治療組炎癥指數(shù)均明顯低于對(duì)照組(P均＜0.001)，而10

11、和20mg/L K5治療組組間比較差異無(wú)顯著意義(P值均＞0.05)。5mg/L組與對(duì)照組比較，差異無(wú)顯著意義(P＞0.05)，但與10和20mg/L組相比，差異有顯著意義(P值均＜0.05)。這些結(jié)果提示K5有抗炎癥作用，且呈劑量依賴性。 組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)10和20mg/L組角膜炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)均明顯低于5mg/L組與對(duì)照組。角膜后膜，一種炎性膜，可在5mg/L組與對(duì)照組中觀察到，而在10和20mg/L組則無(wú)。組織學(xué)研究進(jìn)一步明

12、確了K5在本模型中的抗炎作用。 1.1.5 兔角膜NV面積與角膜后膜及炎性細(xì)胞的相關(guān)性 傷后28天各組兔角膜后膜(層數(shù))、炎性細(xì)胞數(shù)分別與角膜NV面積Pearson等級(jí)相關(guān)分析顯示，各組角膜NV面積與角膜后膜(層數(shù))及炎性細(xì)胞數(shù)呈正相關(guān)。 1.2 K5蛋白抑制角膜新生血管的機(jī)制研究 采用免疫組織化學(xué)和Western blot方法檢測(cè)K5蛋白對(duì)角膜組織中VEGF表達(dá)水平的影響。原代培養(yǎng)了B

13、AEC，BAFC，VSMC，利用MTT檢測(cè)K5蛋白對(duì)細(xì)胞增殖的影響，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的變化，同時(shí)我們還采用電子顯微鏡檢查，DNA片段分析，和TUNEL方法，在體和離體檢測(cè)K5蛋白對(duì)BAEC凋亡的影響。 1.2.1 K5蛋白下調(diào)角膜VEGF的表達(dá) 5mg/L K5組與對(duì)照組中可見(jiàn)VEGF在角膜上皮細(xì)胞、角膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、增殖的角膜基質(zhì)纖維及CNV壁的某些細(xì)胞(如：周細(xì)胞和單核細(xì)胞)上均呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，還在大

14、量的炎性細(xì)胞的胞漿中有強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。10和20 mg／L K5組可見(jiàn)VEGF在上述部位均有弱陽(yáng)性表達(dá)。 采用免疫沉淀的方法將K5對(duì)VEGF表達(dá)的作用進(jìn)行半定量分析，與免疫組織化學(xué)的結(jié)果相同，與PBS對(duì)照組相比，20mg／L K5滴眼液可降低角膜VEGF的水平5倍(P<0.01)，提示K5可降低堿燒傷后角膜中VEGF的表達(dá)。 1.2.2 K5蛋白特異性抑制BAEC的生長(zhǎng) K5蛋白可以劑量和時(shí)間依賴的方式

15、抑制BAEC細(xì)胞增殖，而對(duì)BVSMC或BAFC無(wú)作用，提示K5特異性抑制內(nèi)皮細(xì)胞的作用。 1.2.3 K5蛋白對(duì)BAEC細(xì)胞周期的影響 K5蛋白明顯抑制BAEC S期細(xì)胞百分比和G2+S／G<,1>，使BAEC在G<,1>期發(fā)生細(xì)胞周期停滯。 1.2.4 K5蛋白對(duì)BAEC細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響 80nM K5蛋白明顯改變了內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)，K5治療組的細(xì)胞呈球形且具有一些細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)的異常。

16、細(xì)胞核濃縮是細(xì)胞凋亡的一個(gè)典型特征，染色質(zhì)濃縮出現(xiàn)于細(xì)胞核內(nèi)或細(xì)胞核周邊。同時(shí)可觀察到不同形態(tài)的異?？张?，其周圍含有細(xì)胞碎片，K5治療組的細(xì)胞內(nèi)還可看到凋亡小體，進(jìn)一步證明K5可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。 1.2.5 K5蛋白誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡 瓊脂糖凝膠電泳分析發(fā)現(xiàn)，80nM K5可引起典型的DNA碎片(250-bp至300-bp多倍體)，相反，在對(duì)照組和20nM，40nM K5組均未見(jiàn)，DNA碎片。TUNEL檢測(cè)結(jié)果

17、表明，與對(duì)照組比較，20mg／L K5提高了CNV的凋亡內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)。 第2章 溶血磷脂酸(LPA)在眼表炎癥中的作用 在本研究中，我們假設(shè)LPA在人角膜上皮細(xì)胞中充當(dāng)炎癥介質(zhì)的角色。利用已建立的細(xì)胞株作為模型系統(tǒng)，檢測(cè)LPA的產(chǎn)生，LPA及炎癥因子的信號(hào)反應(yīng)，及LPA受體拮抗劑的作用。 2.1 2.040 pRSV-T角膜上皮細(xì)胞產(chǎn)生LPA及不同介質(zhì)對(duì)LPA產(chǎn)生的影響 2.2 LPS對(duì)LPA產(chǎn)生