水稻GAL4-UAS異位表達系統的建立和花模式形成基因SFL的功能分析.pdf

1、把轉基因的表達限制在特定的時空區(qū)域不僅是研究者們操縱轉基因的主要目標之一，也是更為精確可靠地揭示基因功能的研究思路。GAL4/UAS雙因子異位表達技術體系就是控制基因在特定時空特異表達技術的一種并用于揭示基因的潛在功能。該系統由兩類轉基因株系構成，一類是模式系(或稱作驅動系)，它是由增強子誘捕載體轉化植物所得，這類株系的報告基因時空表達模式代表了驅動蛋白GAL4-VP16(轉錄因子)的表達模式，故篩選報告基因時空特異表達的株系為限制轉基

2、因的時空性表達提供必備條件。另一類是目標系(或稱效應系)，它是由目標載體攜帶目標基因轉化與模式系有相同遺傳背景的植物而來，目標基因就是需要時空限制表達的基因，由只對GAL4-VP16起響應的啟動子UAS所控制，因而在沒有GAL4-VP16蛋白存在時，目標系中的目標基因是沉默的。而在模式系與目標系的雜種后代中，目標基因被組織特異性的GAL4-VP16所驅動而呈現組織特異表達。本研究主要內容是在水稻中建立GAIA/UAs雙因子異位表達技術平

3、臺并利用該技術重點鑒定一些轉錄因子基因的功能。主要結果如下： 1．用增強子誘捕載體pSMR-J18R轉化水稻品種中花11，在潮霉素抗性愈傷階段，篩選GUS不表達的愈傷，并分化為成熟單株，篩選表型正常的株系，鑒定整個生育期GuS報告基因的表達模式，篩選到5個組織特異性表達(P1，花藥；P2，柱頭；P3，花藥；P4，內外稃；P6，葉片和雄蕊)和一個組成型表達的模式系(P7，在所有檢測的組織中表達)。 2．構建通用目標載體pG

4、OFS1和pGOC17。其中，目標載體pGOC17可以利用同源重組方法高效裝載外源基因。 3．在pGOFS1載體基礎上，構建目標基因載體23個，其中轉錄因子載體20個，非轉錄因子載體3個。將這些載體導入農桿菌中，轉化水稻中花11產生各個目標基因的轉基因家系。此外，pGOFS1空載體的轉基因家系則形成ER(EGFP-reporter)報告基因株系。 4．利用Southem雜交，鑒定了13個T<,0>代目標基因家系的插入拷貝

5、數，以及六個模式系的轉基因插入拷貝數。并篩選2到5個表型正常的單拷貝插入目標系用于與模式系雜交。 5．共選擇出14個目標系做母本，與6個模式系父本進行雜交，共計獲得50個雜交組合的雜種。 6．在ER株系與各模式系的雜交后代，發(fā)現GFP可以被各模式系中的GAL4-VP16所激活，并和GAL4-VP16的表達模式類似。 7. 在雜交F<,1>代，出現顯性表型。這些表型包括苗期致死，延遲生長，分蘗數減少，葉片變窄，葉片

6、角度增大，抽穗延遲，花粉不育，雌蕊增多等表型。并發(fā)現突變表型的出現與GFP和GUS共發(fā)生。 8. 證實了雜種P7/T11中表型的改變，如葉片下垂，葉片變窄，分蘗數減少等是由于目標基因被反式激活的緣故。 9. 詳細鑒定了其中一個功能獲得性突變體SFL，該突變體是由P3模式系(花藥特異表達)與T10目標系(目標基因編碼MYB同源蛋白)雜交所得，呈現出多子房結構。 10．通過掃面電鏡和解剖學觀察發(fā)現，這些增多的子房是由

7、雄性器官同源轉換過來。 11. 通過表達分析發(fā)現許多控制雌性器官的基因出現上升表達，如C類基因OsMADS3，OsMADS58，DL，D類基因OsMADS13等。 12．原位雜交顯示在第三輪花器官，出現DL的異位表達，說明SFL在雄蕊的激活表達引起DL的活性。同時發(fā)現，另一C類基因OsMADS3在花器官出現了增強和延伸表達。 13.SFL在雄蕊的異位表達不僅引起多雌蕊結構發(fā)生，還誘發(fā)腫瘤樣結構發(fā)生。通過原位雜交顯

8、示這些腫瘤樣結構具備胚珠細胞特征。雖然SFL在花器官的表達引起了細胞增生，而在其他器官如成熟的葉片中表達則導致細胞死亡。顯示SFL調控細胞的增生或凋亡具有細胞類型特異性。 14. SFL屬于細胞非自主性蛋白，可以在細胞之間移動，因而，有時在其他花器官中也建立了新的心皮結構，如在漿片和內稃的邊緣等區(qū)域。而自身的第四輪花器官則被誘導細胞增生。 15．水稻的外稃則沒有受到影響，且只有內稃的膜狀結構被誘導成柱頭狀結構，結合水稻的

9、其他相關突變體分析，可以初步認為水稻的內稃膜狀邊緣結構相當于擬南芥的花萼結構。 16．原位雜交結果顯示SFL主要限制在花分生組織表達。 17. 共產生RNAi及antisense植株85株，并從中鑒定出SFL下降表達植株共4株。但這些植株均表現正常，暗示SFL可能屬于一個功能冗余基因。 結論：本研究在水稻中已成功地建立了GAL4/UAs雙因子異位表達技術平臺并用于鑒定和發(fā)掘基因的功能。在該系統的基礎上，轉錄因子S