D3T調(diào)控Nrf2-ARE通路對(duì)阿爾茲海默病細(xì)胞模型的保護(hù)作用研究.pdf

1、目的：探討D3T（3H-1,2-dithiole-3-thione）對(duì)阿爾茨海默病細(xì)胞模型是否具有保護(hù)作用及其作用機(jī)制。
　　方法：（1）本實(shí)驗(yàn)采用穩(wěn)定表達(dá)人淀粉樣前體蛋白家族性Swedish突變體的小鼠神經(jīng)瘤細(xì)胞(N2a/APPswe)作為阿爾茲海默病的模型細(xì)胞。使用不同濃度的D3T干預(yù)培養(yǎng)的N2a/APPswe細(xì)胞24h或48h后通過(guò)四甲基偶氮唑（MTT）法檢測(cè)細(xì)胞活性；流式細(xì)胞儀及倒置熒光顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞活性氧（reactiv

2、e oxygen species，ROS）和線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)水平；用丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)MDA水平，進(jìn)一步用ELISA試劑盒檢測(cè)Aβ1-40及Aβ1-42的分泌水平，比較各組的差異。（2）使用40μM的D3T處理N2a/APPswe細(xì)胞24小時(shí)，Real time RT-PCR檢測(cè)Nrf2基因及下游基因HO-1，NQO1的

3、mRNA表達(dá)水平，并用Western Blot檢測(cè)各組間Nrf2蛋白的表達(dá)水平，比較各組間的差異。（3）構(gòu)建Nrf2-siRNA序列，運(yùn)用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)沉默N2a/APPswe細(xì)胞的Nrf2基因，再加入40μM的D3T干預(yù)24小時(shí)后，檢測(cè)轉(zhuǎn)染組及對(duì)照組的ROS、MMP、MDA、Aβ分泌水平等指標(biāo)的變化情況。
　　結(jié)果：（1）10-100μM的D3T對(duì)N2a/APPswe細(xì)胞的活力無(wú)明顯影響。（2）N2a/APPswe細(xì)胞與N2a/W

4、t細(xì)胞相比，ROS及MDA水平升高，MMP水平降低。D3T干預(yù)N2a/APPswe細(xì)胞24h后，可明顯降低N2a/APPswe細(xì)胞的ROS及MDA水平，提高M(jìn)MP水平，并可以減少細(xì)胞內(nèi)外Aβ1-40和Aβ1-42的分泌量。（3）D3T干預(yù)N2a/APPswe細(xì)胞后，Nrf2及NQO1、HO-1的mRNA表達(dá)水平明顯增加，Nrf2蛋白的表達(dá)增多，并可促使Nrf2的核轉(zhuǎn)位。（4）Nrf2-siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，Nrf2的基因表達(dá)明顯抑制，4

5、0μMD3T+Nrf2-siRNA細(xì)胞組與40μMD3T+N-siRNA組相比，ROS及MDA水平升高，MMP水平降低，Aβ1-40和Aβ1-42的分泌量增加。
　　結(jié)論：D3T可減少N2a/APPswe細(xì)胞Aβ的分泌水平及減輕Aβ引起的細(xì)胞氧化損傷，可誘導(dǎo)Nrf2的基因及蛋白表達(dá)上調(diào)，說(shuō)明可激活Nrf2-ARE信號(hào)通路。Nrf2siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，D3T對(duì)沉默Nrf2基因后的N2a/APPswe細(xì)胞的保護(hù)作用明顯減弱，反向說(shuō)明