青藤堿對(duì)人外周血CD4+T細(xì)胞ERK1-2及TNF-α表達(dá)的體外研究.pdf

1、目的:通過人外周血CD4+T淋巴細(xì)胞增殖模型的體外實(shí)驗(yàn),檢測(cè)鹽酸青藤堿(Alkaloid Sinomeuine SIN)對(duì)人外周血CD4+T淋巴細(xì)胞磷酸化的ERK1/2蛋白表達(dá)及TNF-α表達(dá)的體外影響,研究SIN對(duì)人外周血CD4+T淋巴細(xì)胞免疫抑制作用及效應(yīng),進(jìn)一步探討SIN對(duì)人T淋巴細(xì)胞免疫抑制作用的細(xì)胞學(xué)及分子生物學(xué)機(jī)制,為臨床應(yīng)用SIN進(jìn)行器官移植免疫治療提供理論依據(jù)。
　　方法:在衡陽(yáng)市中心血站抽取3個(gè)健康人肘靜脈血50

2、ml,肝素(10U/ml)抗凝。用淋巴細(xì)胞分離液從血液標(biāo)本中分離PBMC,并制成PBMC懸液。通過免疫磁珠分離法從PBMC懸液中分選CD4+T細(xì)胞。將CD4+T細(xì)胞用10％FCS RPMI-1640完全培養(yǎng)液在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。CD4+T細(xì)胞經(jīng)終濃度為5μg/ml的PHA和終濃度為100U/ml的IL-2擴(kuò)增7天后,將擴(kuò)增后的細(xì)胞用PBS洗3遍,繼續(xù)培養(yǎng)(細(xì)胞培養(yǎng)液中不含rIL-2和PHA)1天,細(xì)胞接種于中方瓶,生長(zhǎng)至70

3、%-80%時(shí)(對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期),各組細(xì)胞培養(yǎng)液中加入終濃度1μg/ml的鼠抗人CD3單克隆抗體,繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)后,細(xì)胞的處理分二部分:1、Western blot法檢測(cè)相同濃度不同作用時(shí)間的SIN對(duì)人外周血CD4+T細(xì)胞p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平:1)0min組:細(xì)胞培養(yǎng)液中加入不含任何藥物的與實(shí)驗(yàn)組等量的SIN稀釋液;2)細(xì)胞培養(yǎng)液中加入終濃度為200μmol/L的SIN溶液,分別作用15min,30min,1h,1.5h,2h;2、E

4、LLSA法檢測(cè)TNF-α表達(dá)水平:1)空白對(duì)照組:細(xì)胞培養(yǎng)液中加入不含任何藥物的與實(shí)驗(yàn)組等量的SIN稀釋液;2)CsA組:細(xì)胞培養(yǎng)液中加入終濃度為50ng/ml的CsA溶液;3)低濃度SIN組:細(xì)胞培養(yǎng)液中加入終濃度為10μmol/L的SIN溶液;4)中濃度SIN組:細(xì)胞培養(yǎng)液中加入終濃度為200μmol/L的SIN溶液;5)高濃度SIN組:細(xì)胞培養(yǎng)液中加入終濃度為1000μmol/L的SIN溶液。
　　結(jié)果:1、Western

5、blot法檢測(cè)相同濃度(200μmol/L)不同作用時(shí)間的SIN p-ERK1/2的表達(dá)水平(灰度值):1)0min組:3.15±0.36;2)15min組3.12±0.19;3)30min組:2.50±0.36;4)1h組:2.07±0.21;5)1.5h組:1.35±0.65;6)2h組:0.93±0.13。從結(jié)果可以看出:0min組與15min組比較無(wú)顯著性差異(P>0.05),其余各組與空白對(duì)照組比較均有顯著性差異(P<0.05

6、),2h組灰度值最低,與各組比較均有顯著差異(P<0.05)。SIN能降低人外周血CD4+T細(xì)胞p-ERK1/2的蛋白表達(dá),與SIN作用時(shí)間存在時(shí)間依賴性關(guān)系。2、ELLSA法檢測(cè)TNF-α表達(dá)水平:1)對(duì)照組:680.29±153.27;2)CsA組:209.46±65.33;3)低濃度SIN組:612.94±128.64;4)中濃度SIN組:451.06±70.29;5)高濃度SIN組:261.98±29.33。從結(jié)果可以看出:低濃

7、度CsA組與對(duì)照組無(wú)顯著差異外(P>0.05),其它各組組間TNF-α表達(dá)水平均數(shù)兩兩比較均有顯著性差異(p<0.05)。SIN能濃度依賴性地降低人外周血CD4+T細(xì)胞TNF-α的表達(dá)。
　　結(jié)語(yǔ):SIN能濃度依賴性地降低人外周血CD4+T細(xì)胞TNF-α的表達(dá),相同濃度的SIN與人外周血CD4+T細(xì)胞p-ERK1/2蛋白表達(dá)有時(shí)間依賴性,SIN對(duì)人外周血CD4+T細(xì)胞免疫抑制作用的分子生物學(xué)機(jī)制可能與其抑制p-ERK1/2及TNF