Effects of alkaloid sinomenine on the activity of ERK1-2 and proliferation of CD4+T lymphocytes of human peripheral blood in vi.pdf

1、目的:通過(guò)青藤堿(Alkaloid sinomenine,SIN)對(duì)人外周血CD4+T細(xì)胞ERK1/2活性及增殖率影響的體外研究,探討SIN對(duì)人外周血CD4+T細(xì)胞免疫抑制作用效應(yīng)及可能分子生物學(xué)機(jī)制,為SIN在器官移植領(lǐng)域中的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　方法:在衡陽(yáng)市中心血站抽取3名健康人肘靜脈血50ml,肝素(10U/ml)抗凝。用淋巴細(xì)胞分離液從血液標(biāo)本中分離PBMC,并制成PBMC懸液,通過(guò)免疫磁珠分離法從PBMC懸液中分

2、選CD4+T細(xì)胞,將CD4+T細(xì)胞用10％FCS RPMI-1640完全培養(yǎng)液在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng),CD4+T細(xì)胞經(jīng)終濃度為5ug/ml的PHA和終濃度為100U/ml的IL-2擴(kuò)增7天,將擴(kuò)增后的的細(xì)胞用PBS洗3遍,繼續(xù)培養(yǎng)(細(xì)胞培養(yǎng)液中不含rIL-2和PHA)1天,細(xì)胞接種于中方瓶,生長(zhǎng)至70%-80%時(shí)(對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期),各組細(xì)胞培養(yǎng)液中加入終濃度1ug/ml的鼠抗人CD3單克隆抗體,繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)后,每人細(xì)胞均分為3等份

3、,分別作以下處理:(一)ERK1/2活性檢測(cè)。以P-EIk-1蛋白表達(dá)水平反映ERK1/2活性:(1)不同濃度SIN對(duì)人外周血CD4+T細(xì)胞ERK1/2活性的影響:1)細(xì)胞培養(yǎng)液中加入不含任何藥物但與實(shí)驗(yàn)組等量的SIN稀釋液,2)細(xì)胞培養(yǎng)液中分別加入終濃度為10、200、1000umol/L的SIN溶液,3)細(xì)胞培養(yǎng)液中加入終濃度為50ng/ml的CsA,4)細(xì)胞培養(yǎng)液中加入終濃度為50ng/ml的CsA和200umol/L的SIN溶液

4、,分別作用細(xì)胞2小時(shí);(2)相同濃度SIN不同作用時(shí)間對(duì)人外周血CD4+T細(xì)胞ERK1/2活性的影響:1)0min組:細(xì)胞培養(yǎng)液中加入不含任何藥物但與實(shí)驗(yàn)組等量的SIN稀釋液,2)細(xì)胞培養(yǎng)液中加入終濃度為1000umol/L的SIN溶液,分別作用15min,30min,1h,1.5h,2h;(二)SIN對(duì)人外周血CD4+T細(xì)胞增殖率的影響:MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖率。
　　結(jié)果:一(1)非放射免疫沉淀法檢測(cè)不同濃度SIN對(duì)人外周血

5、CD4+T細(xì)胞ERK1/2活性的影響:應(yīng)用UVP凝膠圖像采集系統(tǒng) X線膠片上的條帶進(jìn)行灰度掃描,以其平均光密度值大小反應(yīng)信號(hào)的相對(duì)強(qiáng)弱,即相對(duì)的表達(dá)量的大小:空白對(duì)照組:2.50±0.08,CsA組:2.47±0.05, CsA+SIN組:0.65±0.19,低濃度SIN組:2.42±0.04,中濃度SIN組:1.37±0.34,高濃度SIN組:0.75±0.22。經(jīng)單向方差分析,低濃度SIN組與空白對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(P>0.05

6、),CsA組與空白對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(P>0.05),其余各組相互比較均有顯著性差異(P<0.05);經(jīng)相關(guān)性分析,SIN的濃度與人外周血CD4+T細(xì)胞ERK1/2活性之間存在負(fù)相關(guān);本實(shí)驗(yàn)還證實(shí),CsA對(duì)人外周血CD4+T細(xì)胞ERK1/2活性無(wú)明顯影響,CsA+SIN組的細(xì)胞光密度值比單獨(dú)CsA組和各濃度SIN組都低,差異有顯著性(P<0.05),這提示我們,雖然CsA本身對(duì)人外周血CD4+T細(xì)胞 ERK1/2活性無(wú)明顯影響,但C

7、sA可協(xié)同SIN降低人外周血CD4+T細(xì)胞ERK1/2活性。一(2)、相同濃度SIN不同作用時(shí)間對(duì)人外周血CD4+T細(xì)胞ERK1/2活性的影響:平均光密度值大小:0min組:2.58±0.18,15min組:2.56±0.16,30min組:1.56±0.27,1h組:1.05±0.31,1.5h組:0.74±0.17,2h組:0.65±0.15。經(jīng)單向方差分析,15min組與空白對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(P>0.05),其余各組之間相互

8、比較均有顯著性差異(P<0.05),2h組灰度值最低,與各組比較均有顯著差異(P<0.05);經(jīng)相關(guān)性分析,SIN降低人外周血CD4+T細(xì)胞ERK1/2活性與SIN作用時(shí)間有關(guān)。二、MTT比色法檢測(cè)CD4+T細(xì)胞增殖率的結(jié)果:經(jīng)藥物處理30小時(shí)后,以MTT比色法測(cè)定各組CD4+T細(xì)胞OD值:空白對(duì)照組:0.87±0.21,CsA組:0.36±0.20,低濃度SIN組:0.80±0.11,中濃度SIN組:0.59±0.15,高濃度SIN組

9、:0.54±0.14,CsA+SIN組:0.31±0.17。經(jīng)單向方差分析,低濃度 SIN組與空白對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(P>0.05),其余各組之間相互比較均有顯著性差異(P<0.05);經(jīng)相關(guān)性分析,SIN的濃度與人外周血CD4+T細(xì)胞增殖抑制率之間存在正相關(guān),本實(shí)驗(yàn)還證實(shí),CsA對(duì)人外周血CD4+T細(xì)胞增殖有明顯抑制作用,CsA+SIN組的細(xì)胞光吸收值比單獨(dú)CsA組和各濃度SIN組都低,差異有顯著性(P<0.05),這提示我們,