新型多功能他克林巰基衍生物ST09對血管性癡呆大鼠認(rèn)知功能的影響及機(jī)制.pdf

1、本文主要從以下幾個方面展開論述:
　　第一部分 ST09設(shè)計合成、體外活性檢測及肝毒性評價
　　目的：血管性癡呆（vascular dementia，VaD）是一種嚴(yán)重威脅中老年人群身體健康和生活質(zhì)量的神經(jīng)系統(tǒng)重大疾病。本課題組的前期研究采用多靶點配體（multi-target-directed ligands，MTDLs）的分子構(gòu)建策略，選用經(jīng)典藥物他克林（tacrine）作先導(dǎo)化合物，在保持乙酰膽堿酯酶（acetylch

2、olinesterase，AChE）抑制活性的基礎(chǔ)上，引入巰基官能團(tuán)，并制備成“前藥”形式，合成了一系列新的多功能化合物。本課題選擇其中效果最好的化合物 ST09，繼續(xù)改進(jìn)其合成路線并初步評價其藥理毒理作用，探索其用于治療血管性癡呆的可能性。
　　方法：化學(xué)合成、核磁共振、質(zhì)譜分析、體外ChE活性篩選、體外細(xì)胞保護(hù)活性評價、類藥性分析、電子自旋共振技術(shù)、體內(nèi)肝毒性評價、HE染色。
　　結(jié)果：優(yōu)化他克林衍生物前藥分子ST09的

3、合成方法，擴(kuò)大合成量，總收率保持在50-60％，其化學(xué)結(jié)構(gòu)經(jīng)波譜解析得到確證。體外藥代動力學(xué)結(jié)果顯示，作為前藥分子的ST09經(jīng)全血孵育后，會迅速轉(zhuǎn)變?yōu)槊撘阴；乃肆謳€基衍生物的形式（ST10），30min內(nèi)的轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到96.72％。體外膽堿酯酶活性測試顯示，ST09和ST10都基本保留了母藥tacrine對AChE的抑制活性，對BuChE的抑制作用稍微減弱。PC12細(xì)胞活性實驗結(jié)果顯示1-30μM ST09對PC12細(xì)胞幾乎無細(xì)胞

4、毒性，對H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷具有較好的保護(hù)性。大鼠體內(nèi)肝毒性分析發(fā)現(xiàn)，ST09給藥組（3.45mg/kg）大鼠血清谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase或glutamic-oxalacetic transaminase，AST/GOT）和谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine transarninase或glutamic-pyruvic transaminase，ALT/GPT）水平與對照組無顯著差異，都處于正常值范圍；

5、肝臟HE染色結(jié)果也與之一致，各組均未表現(xiàn)出肝細(xì)胞損傷。與同等摩爾濃度的tacrine相比，ST09不引起Hepg2細(xì)胞活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平的升高，且其脫乙?；钚孕问絊T10具有顯著的體外自由基清除活性。通過Pallas3.3軟件分析ST09化學(xué)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示ST09滿足lipinski類藥性五規(guī)則（rule of five，Ro5）；而且該化合物具有良好的血腦屏障（blood-brain

6、 barrier，BBB）透過性（TPSA值為71.092），能夠?qū)崿F(xiàn)中樞靶向性。
　　結(jié)論：相對于tacrine，前藥ST09及其活性體內(nèi)代謝產(chǎn)物ST10的乙酰膽堿酯酶抑制活性未發(fā)生顯著改變，但其抗氧化和神經(jīng)保護(hù)活性顯著增加，且對于肝臟細(xì)胞的毒性也明顯降低，說明巰基基團(tuán)的引入產(chǎn)生了“增效減毒”的效果。
　　第二部分 ST09對血管性癡呆大鼠認(rèn)知行為的影響
　　目的：VaD約占癡呆患者總數(shù)的20-30％，是因各種類型的

7、腦血管病所致的認(rèn)知功能障礙而引起的獲得性智能損害綜合征。永久性雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎（permanent occlusion of bilateral common carotidarteries，2-VO）模型是目前國內(nèi)外公認(rèn)的研究VaD的建模方法之一。為評價他克林巰基衍生物ST09對VaD的治療效果，本課題觀察2-VO所致VaD模型大鼠行為學(xué)的改變以及大腦皮層和海馬病理學(xué)特征變化，研究他克林巰基衍生物ST09對VaD大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶損傷

8、的影響。
　　方法：選擇多奈哌齊（Don）作為陽性對照藥。將健康雄性大鼠隨機(jī)分為六組：假手術(shù)（Sham）組、模型組(Model+溶媒）、陽性對照組（Model+Don）、給藥組（Model+ST09低、中、高）三個劑量組。采用2-VO法致大鼠慢性前腦灌注不足，建立學(xué)習(xí)記憶損傷的血管性癡呆模型。術(shù)后1w開始每天腹腔給藥，Sham組和Model組給予生理鹽水，Don組給予0.30mg/kg/day，ST09低、中、高三個劑量組按1.7

9、3mg/kg/day，3.46mg/kg/day和6.92 mg/kg/day，連續(xù)給藥6w后，進(jìn)行大鼠Morris水迷宮有關(guān)空間學(xué)習(xí)和記憶的行為學(xué)檢測。應(yīng)用HE染色觀察皮層和海馬組織病理學(xué)改變。
　　結(jié)果：術(shù)后7w，在定位航行實驗中，Model組大鼠逃避潛伏期明顯長于Sham組[F(1,16)=25.251，P<0.01]；與Model組相比，ST09中、高治療組大鼠潛伏期明顯縮短[F(1,25)=12.845，P<0.001]

10、。隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加，各組大鼠逃避潛伏期逐漸縮短，具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異[F(3,141)=82.902，P<0.01]。在day× group交互影響中，結(jié)果顯示所設(shè)置的給藥方案隨著訓(xùn)練進(jìn)行具有顯著差異[F(15,141)=1.827，P=0.036]。在隱藏平臺后的第1d訓(xùn)練中，各組逃避潛伏期并無顯著性差異F(5,47)=0.576，P=0.718)。第2-4d，各組逃避潛伏期具有顯著性差異[day2：F(5,47)=4.967，P=

11、0.001；day3：F(5,47)=6.670，P<0.001；day4：F(5,47)=11.228，P<0.001]。在訓(xùn)練第2-4 d，與Model組相比，Sham組和ST09中劑量組大鼠逃避潛伏期明顯縮短（P<0.01）；在第3-4d，ST09高劑量組大鼠逃避潛伏期也明顯縮短（P<0.05）。與Model組相比，低劑量ST09組大鼠逃避潛伏期無顯著性差異。在空間探索實驗中，與Model組相比，Sham組大鼠在目標(biāo)象限的時間和路

12、程均明顯延長（P<0.05）；ST09中、高劑量組在目標(biāo)象限的時間均明顯延長（P<0.05or0.01）；ST09中劑量組在目標(biāo)象限的路程明顯延長（P<0.05）。HE染色結(jié)果顯示，Sham組大鼠皮層和海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞排列整齊、形態(tài)完整，核仁清晰。Model組大鼠皮層和海馬腦區(qū)神經(jīng)元丟失，胞核固縮、濃染，出現(xiàn)明顯炎性細(xì)胞浸潤、膠質(zhì)細(xì)胞增生和血管增生。ST09治療組和Don組此類現(xiàn)象得到明顯改善。
　　結(jié)論：ST09對VaD大

13、鼠學(xué)習(xí)和記憶能力有明顯改善作用，并且大鼠皮層和海馬組織病理學(xué)改變程度大大減輕，表明ST09對VaD具有治療作用。
　　第三部分 ST09改善血管性癡呆大鼠認(rèn)知障礙的機(jī)制
　　目的：VaD患者認(rèn)知功能障礙與腦部缺血缺氧引起的膽堿能神經(jīng)功能損傷、氧化應(yīng)激增加和能量供應(yīng)不足都有密切關(guān)系。本課題通過觀察藥物對VaD模型大鼠海馬和皮層組織膽堿能系統(tǒng)損傷、氧化應(yīng)激、神經(jīng)細(xì)胞凋亡水平和腦部葡萄糖代謝的影響，探討ST09治療VaD相關(guān)認(rèn)知障

14、礙的作用機(jī)制。
　　方法：將經(jīng)2-VO造模、給藥和行為學(xué)測試后的SD大鼠斷頭處死，取血清及海馬、皮層組織。選取Sham組、模型組、陽性對照組和中劑量給藥組（3.46mg/kg）四組樣本做后續(xù)研究。血清、海馬和皮層組織勻漿液做抗氧化和氧化損傷指標(biāo)、蛋白巰基含量以及膽堿酯酶活性檢測。以Western Blotting檢測海馬和皮層凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2和活性Caspase-3表達(dá)。以小動物18F-FDG PET成像技術(shù)檢測四組

15、SD大鼠（給藥6w后）進(jìn)行皮層和海馬腦區(qū)的葡萄糖代謝情況。
　　結(jié)果：給藥6w后，Model組大鼠海馬和皮層腦區(qū)SOD活性顯著低于Sham組， ST09（3.46mg/kg）組缺血損傷后的SOD活性得到顯著提高（P<0.05 vs model）。Mode l組大鼠海馬和皮層M DA水平較S ha m組顯著升高，而S T09（3.46mg/kg）組明顯逆轉(zhuǎn)了這兩個腦區(qū)的MDA增加(P<0.01）。Model組大鼠血清、海馬和皮層蛋白

16、巰基含量較Sha m組顯著降低，ST09組則得到顯著改善（P<0.01），并且ST09組血清和腦組織中蛋白巰基含量明顯高于陽性對照藥Don組（P<0.01）。相對于Sham組，Mode l組大鼠皮層和海馬區(qū)凋亡相關(guān)蛋白 Bc l-2/Ba x比值顯著降低，活性caspase3蛋白表達(dá)顯著升高。ST09（3.46mg/k g）明顯逆轉(zhuǎn)缺血損傷所致的凋亡改變，皮層Bc l-2/Ba x表達(dá)從0.632±0.111增至1.697±0.131（

17、P<0.05），海馬從0.238±0.048增加到0.756±0.068（P<0.01）；皮層區(qū)活性caspase-3表達(dá)水平從0.706±0.054降至0.475±0.042(P<0.01)，海馬從0.821±0.036降至0.483±0.076(P<0.01)。小動物18F-FDG PET成像結(jié)果顯示，相對于對照組，模型組大鼠PET示蹤劑的分布顯著減少（P<0.01），說明慢性腦缺血造成皮層和海馬組織葡萄糖代謝減少，而ST09組示蹤