IDO在新月體腎炎中的表達(dá)、意義及其體內(nèi)干預(yù)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、一、研究背景和目的 新月體腎炎是腎臟病理變化最嚴(yán)重進(jìn)展最快的一類腎小球腎炎，是由大量炎性細(xì)胞浸潤腎組織和腎小球包曼氏囊導(dǎo)致的嚴(yán)重腎小球疾病。雖然新月體腎炎發(fā)病率相對較低，但其病變迅速，疾病總的預(yù)后不佳，多數(shù)患者在數(shù)周或數(shù)月內(nèi)發(fā)展至終末期腎功能衰竭而進(jìn)入透析、移植階段。以往認(rèn)為新月體腎炎主要是由體液免疫所介導(dǎo)，但越來越多的研究證據(jù)表明自身抗體介導(dǎo)的體液免疫并非新月體性腎炎發(fā)病的關(guān)鍵機(jī)制，而CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫在疾病的發(fā)生發(fā)

2、展中發(fā)揮更為關(guān)鍵的作用。因此進(jìn)一步研究新月體腎炎發(fā)病機(jī)制中效應(yīng)性T細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控機(jī)理，對新月體腎炎發(fā)病機(jī)制的闡明及尋找新的治療策略具有重要的學(xué)術(shù)意義和實(shí)用前景。 色氨酸是哺乳動物體內(nèi)的必需氨基酸。即使是能合成色氨酸的細(xì)菌在適宜的條件下也會從周圍環(huán)境中攝取色氨酸，由此可見色氨酸在生物代謝中的重要作用。吲哚胺2，3一雙加氧酶(Indoleamine2，3-dioxygenase，IDO)是催化色氨酸代謝通路中的裂解吡咯環(huán)關(guān)鍵步

3、驟的限速酶。近年研究發(fā)現(xiàn)無論是抗原遞呈細(xì)胞如樹突狀細(xì)胞、單核一巨噬細(xì)胞還是其它組織固有細(xì)胞表達(dá)的IDO均可顯著抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫。由于色氨酸是代謝旺盛T細(xì)胞增殖活化中所必需的氨基酸，而犬尿氨酸對T細(xì)胞具有細(xì)胞毒性，可促使rN胞凋亡，因此IDO通過降解色氨酸形成色氨酸耗竭和高犬尿氨酸微環(huán)境能高效誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫耐受的形成。目前IDO已成為T細(xì)胞免疫相關(guān)疾病如母胎耐受、腫瘤免疫逃逸、移植物抗排異以及自身免疫性疾病自身耐受機(jī)制的研究熱點(diǎn)。

4、新近研究表明內(nèi)源性IFN-γ誘導(dǎo)抗原遞呈細(xì)胞IDO表達(dá)上調(diào)可能是內(nèi)源性IFN-γ在多個自身免疫性動物模型和移植物抗排異中發(fā)揮免疫耐受作用的重要機(jī)制，既往研究表明IFN-γ基因敲除鼠可誘導(dǎo)更為嚴(yán)重的新月體腎炎，這些研究資料提示IDO可能在新月體腎炎的發(fā)病機(jī)制中具有重要作用。表達(dá)MHC Ⅱ類分子的腎小管上皮細(xì)胞可作為抗原遞呈細(xì)胞對T細(xì)胞的功能活性進(jìn)行調(diào)控，而IDO最顯著的特征就是表達(dá)于多種抗原遞呈細(xì)胞，IDO在腎炎病變組織尤其腎小管上皮細(xì)胞

5、表達(dá)目前尚未見報(bào)道，因此我們擬研究ID0在新月體腎炎病變中的表達(dá)情況及其在新月體腎炎發(fā)病中可能的作用機(jī)制。 目前最具特征性和最廣泛采用的新月體腎炎動物模型是腎毒血清性腎炎(NTN)模型，其是通過過繼異種抗-GBM抗血清作為腎小球植入抗原而誘導(dǎo)的新月體腎炎?；谝陨戏治觯覀償M首先檢測新月體腎炎患者腎組織中IDO的表達(dá)并探討其意義，之后在體外模擬病理?xiàng)l件下探討腎小管上皮細(xì)胞IDO的表達(dá)變化規(guī)律及其免疫學(xué)效應(yīng)。通過構(gòu)建重組腺病毒Ad

6、-IDO，在新月體腎炎模型鼠體內(nèi)分別給予IDO特異性阻斷劑1-甲基色氨酸和Ad-IDO腺病毒體內(nèi)基因轉(zhuǎn)染干預(yù)NTN大鼠體內(nèi)IDO的生物活性，以IDO未干預(yù)鼠為對照組，通過檢測脾臟淋巴細(xì)胞凋亡率、24h尿蛋白量、腎組織炎細(xì)胞浸潤、增殖以及腎組織病理損害程度以揭示IDO在新月體腎炎發(fā)病機(jī)制中的作用，從而為尋找新月體腎炎治療的新策略提供新思路。 二、方法 1．采用免疫組織化學(xué)染色法檢測正常腎組織和新月體腎炎患者腎組織中IDO和

7、PCNA的表達(dá)情況，同時對腎小管間質(zhì)病變程度進(jìn)行分級，分析腎組織IDO表達(dá)變化與腎組織浸潤PCNA陽性細(xì)胞數(shù)和腎小管間質(zhì)病變程度的相關(guān)性。 2．為了進(jìn)一步明確腎小管上皮細(xì)胞IDO的表達(dá)變化規(guī)律，我們在體外培養(yǎng)人腎小管上皮細(xì)胞株HK2細(xì)胞，模擬病理?xiàng)l件給予IFN-γ刺激培養(yǎng)，通過RT-PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)染色、高效液相色譜(HPLC)等方法檢測不同培養(yǎng)條件下HK2細(xì)胞：IDO的誘導(dǎo)表達(dá)情況。為觀察HK2細(xì)胞誘導(dǎo)表達(dá)IDO的生物學(xué)效

8、應(yīng)，我們將IFN-γ刺激培養(yǎng)后的HK2細(xì)胞與Jurkat T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)，并設(shè)立．IDO阻斷劑共培養(yǎng)組和未予IFN-γ刺激HK2共培養(yǎng)對照組。通過細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測共培養(yǎng)Jurkat細(xì)胞的生長增殖情況并計(jì)算其倍增時間，流式細(xì)胞法檢測各共培養(yǎng)組Jurkat細(xì)胞的細(xì)胞周期及凋亡情況。 3．構(gòu)建Ad-IDO重組腺病毒。首先酶切pOCUS-IDO質(zhì)粒獲得小鼠全長IDOcDNA片段，再將其亞克隆至穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV上，在BJ5

9、183細(xì)菌中和AdEasv-1進(jìn)行同源重組，獲得Ad-IDO重組子，酶切、測序鑒定，并通過脂質(zhì)體法將其轉(zhuǎn)染293細(xì)胞進(jìn)行病毒包裝、擴(kuò)增。對轉(zhuǎn)染Ad-IDO腺病毒重組質(zhì)粒的293細(xì)胞進(jìn)行PCR、生物活性和安全性檢測，同時純化Ad-IDO腺病毒及并測定其病毒滴度。 4．建立NTN大鼠新月體腎炎模型。首先檢測NTN大鼠和正常大鼠血清中色氨酸和犬尿氨酸濃度，之后分別給予NTN大鼠注射Ad-IDO腺病毒或腹腔內(nèi)注射IDO特異性阻斷劑——l

10、-甲基色氨酸以干預(yù)其體內(nèi)IDO活性。以IDO未干預(yù)的NTN大鼠和正常大鼠為對照組，檢測各組大鼠血清色氨酸、犬尿氨酸濃度，并以犬尿氨酸/色氨酸濃度比值反應(yīng)體內(nèi)的IDO活性變化，通過檢測脾臟淋巴細(xì)胞凋亡率、24h蛋白尿量、腎組織病理變化以及腎組織內(nèi)浸潤C(jī)D4+T細(xì)胞、PCNA陽性細(xì)胞情況，以揭示體內(nèi)干預(yù)IDO活性對新月體腎炎病情的影響，從而為IDO在新月體腎炎發(fā)病機(jī)制中作用的闡明提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 三、結(jié)果 1．在正常腎組織未檢

11、測到IDO表達(dá)，PCNA陽性細(xì)胞也非常罕見；而在新月體腎炎標(biāo)本腎小管上皮細(xì)胞IDO的表達(dá)顯著上調(diào)，PCNA陽性細(xì)胞數(shù)也明顯增高。通過分析新月體腎炎患者腎小管上皮細(xì)胞IDO的表達(dá)強(qiáng)度與腎小管間質(zhì)PCNA陽性細(xì)胞數(shù)及腎小管間質(zhì)病理損害程度之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)腎小管上皮細(xì)胞IDO的表達(dá)強(qiáng)度和腎小管-間質(zhì)PCNA陽性細(xì)胞數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)，與腎小管-間質(zhì)病理損害程度之間亦呈顯著負(fù)相關(guān)。 2．正常培養(yǎng)條件下的HK2細(xì)胞不表達(dá)IDOmRNA及ID

12、O，而在IFN-γ刺激培養(yǎng)條件下HK2細(xì)胞IDOmRNA和IDO的表達(dá)顯著上調(diào)，并在一定范圍內(nèi)IFN-γ，刺激IDO的表達(dá)上調(diào)呈時間依賴性和劑量依賴性地增高，高效液相色譜檢測顯示HK2細(xì)胞誘導(dǎo)表達(dá)的IDO具有降解色氨酸的生物活性。與對照組相比，和誘導(dǎo)表達(dá)IDO的HK2細(xì)胞共培養(yǎng)的Jurkat細(xì)胞生長增殖受抑、細(xì)胞周期阻滯于G1期，而S期減少，同時細(xì)胞凋亡率明顯增高，而加1-MT阻斷劑共培養(yǎng)的Jurkat細(xì)胞其生長增殖、細(xì)胞周期和凋亡率與

13、對照組相比無顯著差異。 3．經(jīng)酶切和測序鑒定表明成功構(gòu)建了Ad-IDO腺病毒重組質(zhì)粒。PCR檢測顯示AD293細(xì)胞中包裝擴(kuò)增的腺病毒重組基因組中有目的基因IDO的表達(dá)，而AdΦ腺病毒空載體轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞無IDO表達(dá)。HPLC檢測顯示表達(dá)的IDO具有降解色氨酸的生物學(xué)活性，因此構(gòu)建的Ad-IDO腺病毒具有感染并表達(dá)有生物活性IDO的能力。氯化銫密度梯度離心法純化了Ad-IDO腺病毒，并達(dá)到病毒體內(nèi)轉(zhuǎn)染所需滴度。重組腺病毒對非包裝

14、細(xì)胞Hela細(xì)胞無毒性，說明無野生型病毒的存在。 4．實(shí)驗(yàn)顯示在NTN大鼠血清中色氨酸代謝率較正常大鼠顯著升高。與IDO未干預(yù)NTN鼠相比，Ad-IDO轉(zhuǎn)染NTN鼠的血清色氨酸濃度進(jìn)一步降低，而犬尿氨酸濃度進(jìn)一步升高，同時IDO有效轉(zhuǎn)染了腎組織腎小管上皮細(xì)胞，表明Ad-IDO體內(nèi)注射顯著提高了體內(nèi)IDO的生物學(xué)活性。Ad-IDO腺病毒轉(zhuǎn)染NTN大鼠的脾臟淋巴細(xì)胞凋亡率明顯增加，24h尿蛋白顯著減少，而腎小球新月體比率明顯降低，腎

15、小球和腎小管一間質(zhì)浸潤的CD4+T細(xì)胞和PCNA陽性細(xì)胞數(shù)也顯著減少，各指標(biāo)與IDO未干預(yù)NTN鼠相比差異顯著；相反，腹腔注射1-MT的NTN大鼠其血清色氨酸降解明顯減弱，24h尿蛋白量顯著升高，腎組織病理損傷進(jìn)一步加重，同時腎小球和腎小管-間質(zhì)浸潤C(jī)D41+T細(xì)胞和PCNA陽性細(xì)胞數(shù)也明顯增高，與IDO未干預(yù)NTN鼠相比差異顯著。 四、結(jié)論 1．新月體腎炎患者腎標(biāo)本中。腎小管上皮細(xì)胞IDO的表達(dá)顯著上調(diào)，并且IDO的表

16、達(dá)強(qiáng)度與腎小管間質(zhì)PCNA陽性細(xì)胞數(shù)和腎小管間質(zhì)病變程度顯著負(fù)關(guān)性，結(jié)合體外IFN-γ刺激培養(yǎng)條件下HK2細(xì)胞IDO的表達(dá)變化及其免疫學(xué)效應(yīng)，說明病理?xiàng)l件下腎小管上皮細(xì)胞誘導(dǎo)表達(dá)的IDO可通過調(diào)控腎小管間質(zhì)淋巴細(xì)胞的功能活性而減緩新月體腎炎腎小管間質(zhì)的免疫病理損傷。 2．成功構(gòu)建了具有轉(zhuǎn)染并可表達(dá)生物活性IDO的Ad—IDO重組腺病毒。 3．與正常大鼠相比，NTN大鼠血清中色氨酸降解明顯增強(qiáng)，而用1-MT阻斷IDO活性后