馬鈴薯凝集素修飾聚乙二醇-聚(乳酸-羥基乙酸)共聚物納米粒經(jīng)鼻入腦的遞藥特性研究.pdf

1、血腦屏障的存在限制了大多數(shù)具有治療活性的藥物（尤其是多肽蛋白類(lèi)藥物）進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮療效。鼻腦通路的存在為多肽蛋白類(lèi)藥物避開(kāi)血腦屏障、直接轉(zhuǎn)運(yùn)入腦提供了可能。但多肽蛋白藥物的透黏膜吸收能力差，易被鼻腔中的酶降解，加上鼻纖毛的清除作用，使得經(jīng)鼻轉(zhuǎn)運(yùn)入腦的藥量仍然很低，無(wú)法達(dá)到滿(mǎn)意的治療效果。納米遞藥系統(tǒng)能夠有效減少多肽蛋白藥物的降解，而且有望通過(guò)載體的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)增加藥物的吸收。但普通納米粒仍然存在透鼻黏膜吸收能力有限、鼻腔滯留時(shí)間短等局

2、限。
　　凝集素是一類(lèi)具有高度特異性糖基結(jié)合活性的蛋白質(zhì)或糖蛋白，含有一個(gè)或多個(gè)可與單糖或寡糖特異且可逆結(jié)合的非催化結(jié)構(gòu)域，利用其生物粘附特性可促進(jìn)黏膜對(duì)藥物的吸收。本課題選擇馬鈴薯凝集素(Solanumtuberosumlectin,STL)作為靶向功能分子，將其修飾到聚乙二醇-聚（乳酸-羥基乙酸）共聚物(PEG-PLGA)納米粒的表面，構(gòu)建一種新型的遞藥系統(tǒng)(STL-NP)。STL能與鼻腔嗅黏膜上選擇性高表達(dá)的糖基受體（N-乙

3、酰氨基葡萄糖）特異結(jié)合，延長(zhǎng)遞藥系統(tǒng)在鼻黏膜，尤其是嗅黏膜上的滯留時(shí)間，誘導(dǎo)黏膜的胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)，增加包載藥物經(jīng)鼻入腦的轉(zhuǎn)運(yùn)量，以期提高對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療效果，并降低潛在的外周副作用。
　　本課題研究分為兩個(gè)部分。第一部分首先構(gòu)建了STL修飾的PEG-PLGA納米粒(STL-NP)，并對(duì)該納米遞藥系統(tǒng)進(jìn)行表征。采用Calu-3細(xì)胞模型對(duì)其體外細(xì)胞攝取以及細(xì)胞毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)。通過(guò)測(cè)定載香豆素-6的NP和STL-NP鼻腔給藥后在血和腦組

4、織中的濃度，結(jié)合離體成像觀察納米粒鼻腔給藥后的腦分布情況，評(píng)價(jià)該遞藥系統(tǒng)的腦靶向性，并探索其經(jīng)鼻入腦的轉(zhuǎn)運(yùn)通路。
　　第一部分：
　　第一章，采用復(fù)乳/溶媒蒸發(fā)法制備了PEG-PLGA納米粒，利用納米粒表面的馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)與巰基化凝集素共價(jià)連接，得到馬鈴薯凝集素修飾的PLGA納米粒(STL-NP)。該納米粒粒徑約110nm，Zeta電位約-30mV。X-射線光電子能譜(XPS)分析結(jié)果顯示，STL-NP納米粒表面的主要元素含

5、量發(fā)生變化，表明STL連接至納米粒的表面。紅細(xì)胞凝集實(shí)驗(yàn)證實(shí)納米粒表面連接的凝集素仍保持其凝集紅細(xì)胞的生物活性，并且該凝集作用可被STL特異性糖基（N-乙酰氨基葡萄糖）抑制。
　　第二章，采用Calu-3細(xì)胞模型考察NP和STL-NP的細(xì)胞攝取及細(xì)胞毒性。結(jié)果顯示，Caiu-3細(xì)胞對(duì)STL-NP和NP的攝取均呈時(shí)間、濃度、溫度依賴(lài)性。Calu-3細(xì)胞對(duì)STL-NP有更快的胞吞速度和更強(qiáng)的胞吞能力。特異糖基抑制試驗(yàn)結(jié)果顯示，STL介

6、導(dǎo)納米粒與細(xì)胞表面糖蛋白的特異性結(jié)合是促進(jìn)細(xì)胞攝取的重要條件。胞吞抑制劑的攝取抑制試驗(yàn)結(jié)果顯示:STL-NP首先通過(guò)STL與細(xì)胞表面的N-乙酰氨基葡萄糖殘基結(jié)合促使其吸附在細(xì)胞表面;隨即細(xì)胞通過(guò)包被凹陷、穴樣凹陷以及巨胞飲途徑將納米粒內(nèi)吞;入胞后，通過(guò)各期內(nèi)體，部分納米粒進(jìn)入溶酶體逐漸降解，而部分納米粒逃脫溶酶體繼續(xù)轉(zhuǎn)運(yùn)或在高爾基體的參與下被胞吐排出細(xì)胞;內(nèi)吞和轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程是能量消耗的過(guò)程。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，STL-NP在濃度小于25mg

7、/mL時(shí)無(wú)細(xì)胞毒性，僅在濃度達(dá)50mg/mL時(shí)顯示輕微細(xì)胞毒性。蟾蜍上腭離體模型的結(jié)果顯示，NP和STL-NP對(duì)蟾蜍上腭黏膜纖毛無(wú)明顯毒性。以上結(jié)果說(shuō)明，STL-NP是一種有效且安全的鼻用遞藥系統(tǒng)。
　　第三章，以香豆素-6為熒光探針定量測(cè)定NP和STL-NP鼻腔給藥后在血和腦組織中的濃度，結(jié)果顯示STL修飾后納米粒的鼻腔吸收和腦轉(zhuǎn)運(yùn)速度增快，入腦量提高(p＜0.01)，而吸收入血量降低(p＜0.05)，對(duì)嗅球、大腦和小腦的腦靶向

8、效率分別為NP的1.92、2.45和1.89倍(p＜0.01)。以近紅外染料DiR為熒光探針進(jìn)行離體組織臟器的成像觀察。結(jié)果顯示，STL-NP組在0.25～8h時(shí)間范圍內(nèi)腦部探針信號(hào)均強(qiáng)于NP。STL-NP和NP鼻腔給藥后主要分布于腎、肝、脾、肺等臟器。STL-NP鼻腔給藥后15min，探針信號(hào)即在嗅腦、大腦、腦干等部位廣泛分布。嗅球、前嗅核部位的探針信號(hào)在2h后逐漸減弱，而腦干、大腦、小腦部位的信號(hào)可持續(xù)8h以上。提示STL的修飾促進(jìn)

9、了鼻黏膜對(duì)納米粒的吸收，STL-NP主要沿嗅通路和三叉神經(jīng)通路轉(zhuǎn)運(yùn)入腦，其中三叉神經(jīng)通路的轉(zhuǎn)運(yùn)更為持久。
　　本課題第二部分以堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)為模型藥物，制備了載bFGF的STL修飾PLGA納米粒（STL-bFGF-NP）并進(jìn)行表征，采用同位素標(biāo)記法對(duì)納米粒鼻腔給藥后腦內(nèi)遞藥特性進(jìn)行考察。采用Aβ25-35和IBO海馬區(qū)共同注射建立AD大鼠模型，通過(guò)Morr

10、is水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)bFGF各制劑組對(duì)AD模型大鼠空間學(xué)習(xí)記憶障礙的改善作用，結(jié)合生化指標(biāo)測(cè)定和免疫組化研究觀察海馬區(qū)的病理變化。然后對(duì)STL-bFGF-NP鼻腔連續(xù)給藥3周后的短期毒性進(jìn)行考察，觀察鼻黏膜的細(xì)胞分化和形態(tài)的變化情況，以及對(duì)主要臟器（心、肝、脾、肺、腎）的毒性情況。
　　第二部分：
　　第一章，采用復(fù)乳/溶媒蒸發(fā)法制備包載bFGF的PLGA納米粒(bFGF-NP)，該納米粒與巰基化STL共價(jià)連接制得STL-bF

11、GF-NP。bFGF-NP和STL-bFGF-NP粒徑均為110nm左右，Zeta電位為-30mV左右。STL-bFGF-NP的包封率和載藥量較bFGF-NP會(huì)有所降低。bFGF-NP在血漿和鼻黏膜勻漿液中的穩(wěn)定性較bFGF明顯提高。bFGF-NP在血漿和鼻洗液中雖有一定的突釋(0.5h的釋放量分別為11.40％和6.32％)，但24h累積釋放量分別為73.09％和41.91％，顯示出一定的緩釋作用。
　　第二章，采用碘標(biāo)記法對(duì)S

12、TL-bFGF-NP鼻腔給藥后的腦內(nèi)遞藥特性及體內(nèi)分布進(jìn)行考察。結(jié)果顯示，bFGF溶液、bFGF-NP和STL-bFGF-NP鼻腔給藥后入腦量均較bFGF溶液靜脈給藥提高，其中STL-bFGF-NP在嗅球、大腦、小腦中的AUC0-24h分別為bFGF溶液靜脈給藥組、bFGF溶液鼻腔給藥組、bFGF-NP組的1.79～5.17倍(p＜0.05)、1.61～3.21倍(p＜0.05)和1.19～2.06倍(p＜0.05)，腦靶向效率也分別提

13、高3.61～10.5倍(p＜0.01)、1.33～2.69倍(p＜0.05)和1.18～2.06倍(p＜0.01)。STL-bFGF-NP鼻腔給藥后轉(zhuǎn)運(yùn)到三個(gè)腦組織的直接轉(zhuǎn)運(yùn)百分率均大于70％，尤其對(duì)嗅球的直接轉(zhuǎn)運(yùn)百分率高達(dá)90％，說(shuō)明STL修飾后促進(jìn)了藥物經(jīng)嗅通路轉(zhuǎn)運(yùn)入腦。體內(nèi)分布結(jié)果顯示，bFGF各制劑組鼻腔給藥后在各臟器的分布均顯著低于靜脈給藥組，尤其在腎、肝、脾中分布的減少有利于降低bFGF的外周副作用，提高其臨床應(yīng)用性。bFG

14、F-NP和STL-bFGF-NP組在各臟器中的分布較bFGF溶液鼻腔給藥組無(wú)顯著性差異。
　　第三章，藥效學(xué)研究結(jié)果顯示，bFGF各制劑組對(duì)AD模型大鼠的空間記憶障礙有不同程度的改善作用，其中STL-bFGF-NP組(20μg/kg/d)顯示出更快的學(xué)習(xí)速度。bFGF-NP高劑量組(40μg/kg/d)和STL-bFGF-NP組在長(zhǎng)期和短期記憶考察中均顯示出更好的記憶效果。STL-bFGF-NP治療可降低AD大鼠海馬AChE活性，

15、提高ChAT水平至AD模型組的2.04倍，對(duì)膽堿能神經(jīng)纖維具有維持存活和營(yíng)養(yǎng)保護(hù)的作用;且能夠減輕Aβ斑塊在海馬區(qū)的沉積，減少海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，從而對(duì)AD模型大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。
　　第四章，對(duì)STL-bFGF-PLGA納米粒進(jìn)行了為期3周的短期毒性考察，結(jié)果顯示鼻黏膜及心、肝、脾、肺等臟器均未發(fā)生明顯的組織病理學(xué)改變。由于腎臟是bFGF的主要毒性靶器官，鼻腔給藥組的變性程度較靜脈給藥組明顯減輕，提示鼻腔給藥可減輕