HIF-1α基因沉默對口腔癌CEACAM1和VEGF-C表達及脈管生成影響的研究.pdf

1、實驗目的:
　　 1.觀察研究HIF-1α在口腔鱗狀細胞癌中表達及與CEACAM1、VEGF-C表達的關系,分析CEACAM1對血管和淋巴管生成的影響,初步探討HIF-1α、CEACAM1、VEGF-C在口腔癌血管和淋巴管生成中的作用及可能的機制。
　　 2.觀察RNAi基因沉默HIF-1α對舌鱗狀細胞癌細胞系Tca8113表達HIF-1α的影響,并觀察研究HIF-1α基因沉默對CEACAM1和VEGF-C表達的影響,探

2、討HIF-1α/CEACAM1/VEGF-C的調(diào)控關系及在腫瘤脈管生成中的作用機制。
　　 3.以口腔癌裸鼠移植瘤模型為研究對象,研究HIF-1α基因沉默對腫瘤CEACAM1和VEGF-C表達的影響,驗證HIF-1α/CEACAM1/VEGF-C對腫瘤血管和淋巴管生成的作用,以及對腫瘤增殖和進展的影響；探討HIF-1α/CEACAM1/VEGF-C通路對腫瘤脈管生成及其正?；挠绊懠白饔脵C制。
　　 研究方法:
　

3、　 1.以人口腔鱗狀細胞癌為研究對象,檢測人口腔鱗狀細胞癌中HIF-1α、CEACAM1和VEGF-C表達
　　 收集2005-2007年山東大學齊魯醫(yī)院和山東大學口腔醫(yī)院口腔癌手術(shù)標本91例,其中包括舌鱗狀細胞癌標本30例。患者臨床資料包括年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤臨床分期、腫瘤分化程度。應用免疫組化方法檢測HIF-1α和CEACAM1在91例口腔鱗狀細胞癌中的表達及定位,并對免疫組化結(jié)果進行分析,評價蛋白的表達與臨床資料之

4、間的關系。檢測30例舌鱗狀細胞癌中VEGF-C表達,并與HIF-1α和CEACAM1在舌癌中的表達進行對比,統(tǒng)計分析HIF-1α與CEACAM1和VEGF-C在舌癌中表達的相關性,并進一步分析在HIF-1α高表達情況下,CEACAM1表達與腫瘤脈管生成的關系。
　　 2.以人口腔癌為研究對象,檢測人口腔癌中MVD和LVD以及脈管內(nèi)皮細胞表型轉(zhuǎn)化情況
　　 采用免疫組化方法,分別應用血管標記CD31和淋巴管標記LYVE-1

5、檢測口腔癌中血管和淋巴管生成情況,統(tǒng)計血管密度和淋巴管密度。免疫組化雙標記和免疫熒光雙標記檢測新生脈管表型轉(zhuǎn)化情況,并分析其與CEACAM1表達的關系。
　　 3、以人舌鱗狀細胞癌細胞系Tca8113細胞為研究對象,檢測RNAi慢病毒干擾載體對Tca8113細胞HIF-1α基因的干擾效率
　　 Tca8113細胞在37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng),取生長狀態(tài)良好的細胞以4×104/孔接種于6孔培養(yǎng)板中,每孔加入2mlDMEM

6、培養(yǎng)基。48小時后,細胞融合率可達到30～50％。將細胞分為空白對照組、陰性載體對照組和干擾組,分別加入ENi.S.、NC-GFP-Lentivirus和HIF-1α-RNAi-Lentivirus(復感染指數(shù)MOI為75),37℃、5％CO2孵箱中繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)。每天倒置熒光顯微鏡觀察細胞生長,通過觀察慢病毒上報告基因GFP的表達情況,評估感染效率。RNA干擾后第五天,通過觀察GFP評估細胞感染率約為70-80％,收集細胞,提取細胞總R

7、NA,應用Real time RT-PCR方法檢測不同實驗組中HIF-1α基因水平表達,Realtime RT-PCR數(shù)值分析采用標準曲線分析法。RNA干擾后第五天,收集細胞,提取細胞總蛋白,應用Western-blot方法檢測不同實驗組中HIF-1α的蛋白表達水平。
　　 4.以Tca8113細胞為研究對象,檢測HIF-1α沉默對CEACAM1、VEGF-C基因和蛋白水平表達的影響
　　 Tca8113細胞培養(yǎng)并感染慢

8、病毒顆粒,RNA干擾后第五天,通過觀察GFP評估細胞感染率約為70-80％,收集細胞,提取細胞總RNA,應用real timeRT-PCR方法檢測不同實驗組中HIF-1α、CEACAM1和VEGF-C基因水平的表達,real time RT-PCR數(shù)值分析采用標準曲線分析法。RNA干擾后第五天,收集細胞,提取細胞總蛋白,應用Western-blot方法檢測不同實驗組中HIF-1α的蛋白表達,再次驗證蛋白表達水平干擾效率。同時收集細胞,采

9、用流式細胞術(shù)檢測CEACAM1的表達。
　　 5.建立HIF-1α基因沉默的口腔癌裸鼠移植瘤模型并觀察脈管生成及腫瘤進展
　　 觀察口腔癌裸鼠移植瘤的增殖進展和荷瘤鼠生存情況,檢測移植瘤增殖活性及CEACAM1和VEGF-C表達情況,觀察腫瘤脈管生成情況及其形態(tài)結(jié)構(gòu)和內(nèi)皮細胞表型轉(zhuǎn)化情況,分析HIF-1α基因沉默與CEACAM1和VEGF-C表達及脈管生成的關系。
　　 建立口腔癌裸鼠移植瘤模型:37℃、5％CO

10、2孵箱中培養(yǎng)Tca8113細胞,將生長狀態(tài)良好的細胞以4×104/孔接種于6孔培養(yǎng)板中,每孔加入2mlDMEM培養(yǎng)基。48小時后,細胞融合率可達到30～50％。將細胞分為空白對照組、陰性對照組和干擾組,分別加入ENi.S.、NC-GFP慢病毒顆粒和HIF-1α-RNAi慢病毒載體(復感染指數(shù)MOI為75),37℃、5％CO2孵箱中繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)。在細胞生長狀態(tài)良好時配制細胞懸液,細胞濃度為2×106個/ml,備用。5周齡的BALB/Cnu

11、/nu雌性裸鼠30只,(中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所),分為空白對照組、陰性對照組和干擾組,每組10只,注射0.1ml空白對照組、陰性對照組和干擾組Tca8113細胞懸液(細胞數(shù)量為2×105個)于裸鼠背部皮下。接種腫瘤細胞后,將裸鼠置于SPF飼養(yǎng)條件下飼養(yǎng),每天觀察裸鼠背部的成瘤情況并在成瘤后定期對腫瘤大小進行測量。
　　 四周后每組裸鼠中的5只分別乙醚吸入麻醉后進行熒光實時活體成像,然后脫頸處死,收集腫瘤標本。將收集的裸鼠腫

12、瘤標本進行常規(guī)處理制備成蠟塊,應用免疫組化方法檢測三組裸鼠腫瘤標本中CEACAM1、VEGF-C、Ki67、LYVE-1(抗鼠)和CD31(抗鼠)的表達,并計數(shù)評估MVD和LVD,觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)變化,免疫雙標記法檢測新生脈管內(nèi)皮細胞表型變化,研究HIF-1α基因沉默后對裸鼠移植瘤血管和淋巴管生成及其形態(tài)學改變和正?；挠绊憽?br>　　 6.觀察口腔癌裸鼠移植瘤模型生存情況
　　 三組裸鼠每組剩余5只繼續(xù)在SPF飼養(yǎng)條件下飼養(yǎng)

13、,觀察研究荷瘤鼠生存情況,并進行生存分析。
　　 結(jié)果:
　　 1.HIF-1α在口腔鱗狀細胞癌中高表達,并與CEACAM1和VEGF-C表達呈正相關
　　 2.CEACAM1表達模式與口腔癌分化密切相關,并與腫瘤脈管生成和內(nèi)皮細胞表型轉(zhuǎn)化相關
　　 3.RNAi慢病毒干擾載體有效抑制HIF-1α基因水平和蛋白水平表達
　　 4.基因沉默HIF-1α后CEACAM1基因水平和蛋白水平表達下調(diào)

14、>　　 5.基因沉默HIF-1α后VEGF-C基因水平和蛋白水平表達下調(diào)
　　 6.HIF-1α基因沉默組口腔癌裸鼠移植瘤模型中CEACAM1和VEGF-C表達顯著下調(diào),脈管生成明顯減弱,形態(tài)結(jié)構(gòu)有明顯的正?；厔?br>　　 7.HIF-1α基因沉默降低口腔癌裸鼠移植瘤增殖活性,降低腫瘤生長速度,延長荷瘤裸鼠生存期
　　 結(jié)論:
　　 1.HIF-1α在人口腔鱗狀細胞癌中高表達,并且與CEACAM1和VEG

15、F-C表達呈正相關。CEACAM1表達與腫瘤分化程度關系密切,并與腫瘤脈管生成相關。CEACAM1陽性病例中,血管和淋巴管生成顯著增高,內(nèi)皮細胞表型轉(zhuǎn)化也更活躍,這表明在HIF-1α高表達口腔癌中,HIF-1α可能通過調(diào)控CEACAM1和VEGF-C的表達,促進腫瘤血管和淋巴管生成,并對腫瘤血管內(nèi)皮細胞和淋巴管內(nèi)皮細胞表型轉(zhuǎn)化具有重要作用。
　　 2.體外實驗顯示HIF-1α基因沉默顯著抑制HIF-1α基因水平和蛋白水平表達,同

16、時隨著HIF-1α表達降低,CEACAM1和VEGF-C在基因水平和蛋白水平表達均下調(diào)。這表明在人口腔癌中HIF-1α可以調(diào)控CEACAM1和VEGF-C表達,HIF-1α/CEACAM1/VEGF-C可能在口腔癌脈管生成中具有重要作用。
　　 3.體內(nèi)實驗顯示,HIF-1α基因沉默組口腔癌裸鼠移植瘤模型HIF-1α表達明顯降低,腫瘤血管和淋巴管生成被顯著抑制,并且脈管結(jié)構(gòu)形態(tài)明顯趨于正常,血管內(nèi)皮細胞和淋巴管內(nèi)皮細胞表型轉(zhuǎn)化也

17、更趨穩(wěn)定,同時,干擾組移植瘤CEACAM1和VEGF-C表達都明顯下調(diào),表明RNA干擾基因沉默HIF-1α后,通過下調(diào)CEACAM1和VEGF-C表達抑制腫瘤血管和淋巴管生成,并介導內(nèi)皮細胞的表型轉(zhuǎn)化,使腫瘤脈管系統(tǒng)形態(tài)結(jié)構(gòu)趨于正常。HIF-1α基因沉默還顯著降低裸鼠移植瘤增殖活性和生長速度,延長荷瘤裸鼠生存期,這表明HIF-1α基因沉默導致受HIF-1α調(diào)控的細胞增殖相關基因活性降低,使得處于靜止期的腫瘤細胞比例增高,腫瘤增殖活性降低

18、,延遲了腫瘤的異質(zhì)性進展過程,有利于荷瘤鼠生存期延長。此外,干擾組移植瘤新生脈管系統(tǒng)形態(tài)結(jié)構(gòu)趨于正常也會使其功能在一定程度上趨于正常,趨于正常化的脈管系統(tǒng)形成的微環(huán)境抑制了腫瘤細胞在乏氧環(huán)境下的異質(zhì)性克隆篩選,也會延緩腫瘤的異質(zhì)化進程,也有利于荷瘤鼠生存期的延長。
　　 4.HIF-1α沉默通過下調(diào)口腔癌CEACAM1和VEGF-C的表達抑制口腔癌血管和淋巴管生成,促進新生血管和淋巴管結(jié)構(gòu)功能的正常化,并能有效抑制腫瘤增殖活性和