蝶腭神經(jīng)節(jié)程序電刺激對蛛網(wǎng)膜下腔出血后延遲性腦血管痙攣的作用及機制的實驗研究.pdf

1、蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoidhaemorrhage，SAH)后約有40～70％的患者發(fā)生腦血管痙攣(cerebralvasospasm，CVS)，其中延遲性腦血管痙攣(delayedcerebralvasospasm，DCVS)約20～30％的發(fā)生率，蛛網(wǎng)膜下腔出血后2周約10～20％的不良預(yù)后系腦血管痙攣引致[1,2]，DCVS導(dǎo)致的腦缺血是SAH患者死亡或殘疾的主要原因。多年來，腦血管痙攣導(dǎo)致如此高的不良預(yù)后，促使許多學

2、者對其治療方法或策略進行了廣泛的研究，試圖防治或逆轉(zhuǎn)腦血管痙攣，以減輕或防止缺血性腦損害的發(fā)生。這些方法包括尼莫地平、血液動力學治療以及介入神經(jīng)放射學措施如動脈內(nèi)罌栗堿的灌注、球囊血管成型術(shù)等。但是所有這些方法在臨床應(yīng)用中都未能被證實有效[1,2]。因此，尚需對腦血管痙攣的防治進行深入的研究，以探尋新的有效的防治方法。 蝶腭神經(jīng)節(jié)屬于膽堿能神經(jīng)通路中的副交感節(jié)后神經(jīng)元，支配顱內(nèi)前循大部分環(huán)血管[3,4,5]?；陬A(yù)實驗證實電刺激

3、蝶腭神經(jīng)節(jié)可以引致同側(cè)前循環(huán)腦血管擴張，亦能擴張痙攣的腦血管的現(xiàn)象；本研究針對SAH后腦血管痙攣系腦血管收縮與舒張失平衡且呈遲發(fā)緩慢持續(xù)過程的病理生理特點，首次提出程序電刺激刺蝶腭神經(jīng)節(jié)(programmedeclectricstimulationofsphenopalatineganglion，PESSPG)治療SAH后腦血管痙攣的方法，通過建立Beagle犬SAH腦血管痙攣模型，采用自行設(shè)計的蝶腭神經(jīng)節(jié)程序刺激器，研究PESSPG前

4、后犬神經(jīng)功能評級、進食量的變化，腦脊液、腦血管外膜的Ach，NOS，ET水平變化，結(jié)合腦血管血流動力學，血管內(nèi)皮細胞凋亡、海馬神經(jīng)元凋亡等相關(guān)檢測，探討PESSPG治療DCVS的可行性、有效性；同時進一步探討PESSPG治療DCVS的機制。本研究分為以下四部分： 第一部分：蛛網(wǎng)膜下腔出血遲發(fā)血管痙攣的動物模型建立 目的：建立成功的犬SAH性腦血管痙攣模型，為下一步實驗提供穩(wěn)定、良好的動物模型。 材料與方法：健康成

5、年Beagle犬20只，體重15～17kg，隨機分為模型組18只，對照組2只。采用速眠新Ⅱ注射液以0.08ml/kg的劑量肌肉注射將犬麻醉。用9＃腰椎穿刺針經(jīng)環(huán)枕縫刺入蛛網(wǎng)膜下腔，按0.5ml/kg放出腦脊液，然后穿刺股動脈，抽出動脈血(不加抗凝劑)，按0.5ml/kg經(jīng)腰椎穿刺針以2ml/min的速度注入蛛網(wǎng)膜下腔。將動物置頭低足高位與地面呈30度角，30分鐘。24小時后重復(fù)上述步驟，動物模型制作完成。期間分別作DSA、TcD監(jiān)測，并

6、從進食量、神經(jīng)功能、病理組織學等方面于后1d、3d、7d、14d時間點對模型進行評估。 結(jié)果：穿刺死亡兩只，余16只犬神經(jīng)功能障礙分級：6只犬神經(jīng)功能障礙為Ⅳ級，8只犬為Ⅲ級，2只犬為Ⅱ級。進食量評級：Ⅲ級7只，Ⅱ級6只，Ⅳ級3只。16只模型犬DSA顯示大腦中動脈、基底動脈均有顯著痙攣表現(xiàn)，TCD顯示大腦中動脈血流動力學變化有顯著痙攣改變。大體解剖見大量血液沉積基底池、橋池的大動脈周圍，腦底部蛛網(wǎng)膜輕度增厚、黃變，基底池見暗紅色

7、的小凝血塊，基底動脈管壁變細、變硬，血管壁有炎性反應(yīng)，周圍見增厚的蛛網(wǎng)膜束、絲。病理組織學檢查見血管內(nèi)皮細胞損傷，顯示腦血管發(fā)生顯著痙攣。 結(jié)論：應(yīng)用自體動脈血枕大池二次注血法，可以建立犬SAIl性DCVS模型，為下一步實驗打下了良好、可靠的動物模型基礎(chǔ)。 第二部分：PESSPG對犬DCVS的作用 目的：評價蝶腭神經(jīng)節(jié)程序刺激能否逆轉(zhuǎn)犬蛛網(wǎng)膜下腔出血后產(chǎn)生的延遲性腦血管痙攣。 材料與方法：16只雄性成年B

8、eagle犬，經(jīng)枕大池二次注血法制作CVS模型，并經(jīng)DSA、TCD監(jiān)測以及犬神經(jīng)功能、進食量評分確認腦血管痙攣模型的成功建立(見第一部分)；隨機將16只CVS犬分為PESSPG治療組10只與假刺激對照組6只。繼之，通過顯微手術(shù)將同心圓雙極刺激電極植入治療組犬的左側(cè)翼腭窩內(nèi)確認刺激電極接觸蝶腭神經(jīng)節(jié)，連接刺激線，并經(jīng)皮下隧道引至背部皮下，連接刺激器，固定。PESSPG治療組于SAH后第四日，證實發(fā)生DCVS后打開刺激器予以程序刺激；對照組

9、犬予以手術(shù)植入電極，予以假刺激。期間，PESSPG組與對照組犬分別作DSA、TCD監(jiān)測，并觀察癥狀學改變(神經(jīng)功能評級、進食量評級)，將SAH前后DSA、TCD測得參數(shù)及癥狀學改變比較，組間比較采用單因素方差分析，治療前后采用配對t檢驗。 結(jié)果：PESSPG治療組犬10只，均存活，治療前后神經(jīng)功能評級、進食量評級、DSA測得大腦中動脈直徑、TCD測得大腦中動脈血流速度有顯著性改善。對照組犬6只，死亡1只，5只存活，且同時期比較神

10、經(jīng)功能評級、進食量評級及DSA、TCD評估均較假治療前以及PESSPG治療組治療后明顯加重。 結(jié)論：PESSPG治療蛛網(wǎng)膜下腔出血后DCVS是可行、有效的。 第三部分：PESSPG對DCVS犬海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡的影響 目的：探討PESSPG對SAH后DCVS犬海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡的影響。 材料與方法：9只成年雄性Beagle犬，隨機分為7只SAH模型組及2只正常對照組。SAH模型組7只經(jīng)枕大池二次注

11、血法制作DCVS模型，并經(jīng)DSA、TCD監(jiān)測以及犬神經(jīng)功能、進食量評價確認DCVS模型的成功建立(見第一部分)。模型組7只犬隨機分為治療組5只及假治療組2只。通過顯微手術(shù)將同心圓雙極刺激電極植入PESSPG治療組犬的左側(cè)翼腭窩內(nèi)確認刺激電極接觸蝶腭神經(jīng)節(jié)，連接刺激線，并經(jīng)皮下隧道引至背部皮下，連接刺激器，固定。PESSPG治療組于SAH后第四日，證實發(fā)生CVS后打開刺激器予以程序刺激；同時，假治療組犬予電極植入，予以假刺激。期間，PES

12、SPG治療組、假治療組犬、正常對照組犬分別作DSA、TCD監(jiān)測，并觀察神經(jīng)功能改變，將SAH前后DSA、TCD測得參數(shù)及神經(jīng)功能改變比較。于治療后14天各組動物予以全身深度麻醉(同第一部分)，經(jīng)心臟灌注磷酸鹽緩沖液體，斷頭取海馬組織通過RT-PCR技術(shù)檢測海馬CA1區(qū)神經(jīng)元Bcl-2及Caspase-3的表達。各組結(jié)果予以統(tǒng)計學分析。 結(jié)果：PESSPG治療組犬的癥狀學評級與DSA、TCD測得參數(shù)均較假治療組顯著改善。PESSP

13、G治療組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元Caspase-3表達較假治療組降低(P＜0.01)，而海馬CA1區(qū)Bcl-2表達較假治療組增加(P＜0.01)。 結(jié)論：PESSPG治療在顯著改善血管痙攣動物的神經(jīng)功能的同時，尚能減輕神經(jīng)元的壞死，而具有神經(jīng)保護作用。蝶腭神經(jīng)節(jié)刺激可能是通過提高Bc卜2表達從而降低Caspase-3活性，或同時作用于上述兩個環(huán)節(jié)而起到神經(jīng)保護作用的。 第四部分：PESSPG對SAH后DCVS作用機制的初步探討

14、 目的：初步探討蝶腭神經(jīng)節(jié)程序刺激治療蛛網(wǎng)膜下腔出血導(dǎo)致的遲發(fā)性腦血管痙攣的機制。 材料與方法：18只雄性成年Beagle犬，隨機分為16只SAH組及2只正常對照組。16只SAH組經(jīng)枕大池二次注血法制作SCVS模型，并經(jīng)DSA、TCD監(jiān)測以及犬神經(jīng)功能、進食量評分確認腦血管痙攣模型的成功建立(見第一部分)；SAH組16只犬隨機分為PESSPG治療組10只與假刺激組6只。各組犬分別作DSA、TCD動態(tài)監(jiān)測，并觀察癥狀學改變

15、。同時于SAH前、后1、3、5、14天時間分別留取各組犬腦脊液，通過酶聯(lián)免疫吸附測試檢測AchE、ET-1、NOS的水平。SAH后14天處死動物，經(jīng)心臟灌注后取標本：大腦中動脈、基底動脈、蝶腭神經(jīng)節(jié)，應(yīng)用免疫組化技術(shù)作各組石蠟標本的NOS、AchE染色，觀察相應(yīng)組織的NOS、AchE分布密度改變；同時各組大腦中動脈、基底動脈予以原位細胞凋亡檢測法(TUNEL)檢測血管內(nèi)皮細胞的凋亡情況。組間差異應(yīng)用單因素方差分析，兩兩比較應(yīng)用LSD法。

16、 結(jié)果： ①PESSPG組犬的SPG的NOS染色陽性神經(jīng)元分布密度顯著提高、AchE染色陽性分布密度減少； ②PESSPG組犬大腦中動脈血管壁NO、Ach染色纖維密度顯著提高； ③PESSPG組犬基底動脈血管壁NOS、AchE染色無明顯改變。 ④PESSPG組犬腦脊液AchE的水平下降、NOS的水平增高(P＜0.01)，ET-1的水平無明顯改變(P＞0.05)。 ⑤PESSPG組犬的大腦中