慢病毒介導(dǎo)的miRNA-302c對腹膜間皮細(xì)胞EMT的干預(yù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、慢性腎臟病(Chronic Kidney Disease，CKD)是全球關(guān)注的公共衛(wèi)生問題之一，國內(nèi)外發(fā)病率逐年上升。約5％的CKD患者最終將發(fā)展成終末期腎功能衰竭，需終身接受腎臟替代治療。其中，腹膜透析(peritoneal dialysis，PD)是符合我國國情的主要腎臟替代治療方法，但長期PD可引起腹膜纖維化，導(dǎo)致超濾衰竭(ultrafiltration failure，UFF)，進(jìn)而影響PD的長期應(yīng)用，是患者退出PD的主要原因。

2、轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)是腹膜纖維化發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵因素，近年來多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)腹膜間皮細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化(epithelial mesenchymal transition，EMT)在TGF-β誘導(dǎo)的腹膜纖維化中起重要作用，是腹膜纖維化啟動和可逆的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和分

3、化等作用，研究證實(shí)CTGF通過介導(dǎo)TGF-β1，或直接作用其下游信號分子，與許多組織器官纖維化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。已有研究發(fā)現(xiàn)，CTGF不僅在PD腹膜纖維化中起到關(guān)鍵作用，并且在纖維化的始動過程EMT的發(fā)生中也起到重要促進(jìn)作用。
　　microRNAs(miRNA)屬于功能性非編碼RNA，通過降解目標(biāo)mRNA或抑制其翻譯調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄后水平的表達(dá)，參與調(diào)控生長發(fā)育，細(xì)胞分化、增殖、凋亡，腫瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展，是目前生命科學(xué)領(lǐng)域的研究

4、熱點(diǎn)。有研究證實(shí)miRNA是TGF-β1誘導(dǎo)EMT的重要調(diào)節(jié)因子，如miRNA-200家族和miRNA-205。但是，miRNA在腹膜纖維化領(lǐng)域的研究尚未見文獻(xiàn)報道。近期，我們采用高通道m(xù)iRNA芯片技術(shù)對PD病人腹透流出液腹膜間皮細(xì)胞miRNA的表達(dá)進(jìn)行了圖譜分析，發(fā)現(xiàn)miRNA的異常表達(dá)與PD患者腹膜EMT及纖維化密切相關(guān)。
　　隨著基因治療技術(shù)及基因載體系統(tǒng)的發(fā)展，對于PD患者腹膜纖維化的分子機(jī)制和干預(yù)治療研究取得了進(jìn)一步的

5、發(fā)展，大量在PD的動物模型中進(jìn)行的基因治療研究證實(shí)了基因治療方法在腹膜纖維化機(jī)制研究和治療中的可行性。慢病毒載體(lentiviral vector，LV)作為目前被廣泛應(yīng)用的基因載體，具有轉(zhuǎn)染效率高，插入外源基因容量大，能感染分裂期和非分裂期細(xì)胞，并且不會引起明顯免疫和炎癥反應(yīng)等優(yōu)勢，將其應(yīng)用于腹膜纖維化的研究十分有意義。
　　基于以上分析，我們認(rèn)為某些miRNA可參與調(diào)節(jié)腹膜間皮細(xì)胞EMT，以慢病毒載體為基因轉(zhuǎn)染工具，從miR

6、NA著手研究其在PD過程中EMT及纖維化的作用及分子機(jī)制具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。
　　第一章腹腔注射慢病毒轉(zhuǎn)染小鼠腹膜間皮細(xì)胞效應(yīng)的研究
　　目的：通過小鼠腹腔注射不同滴度的攜帶綠色熒光蛋白(greenfluorescence protein，GFP)基因的慢病毒，觀察其轉(zhuǎn)染小鼠腹膜間皮細(xì)胞的效應(yīng)，探討腹腔注射慢病毒轉(zhuǎn)染小鼠腹膜間皮細(xì)胞最佳效應(yīng)滴度。
　　方法12周齡ICR雄性小鼠，體重28-30克。隨機(jī)分為對照組(

7、n=5)、LV-GFP1組(n=5)、LV-GFP2組(n=5)、LV-GFP3組(n=5)。分別一次腹腔注射1.5ml0.9％生理鹽水或者不同滴度的慢病毒。于第28天處死小鼠，壁層腹膜用于HE和Masson染色觀察腹膜形態(tài)變化、冰凍切片觀察GFP表達(dá)，臟層腹膜用于提取組織mRNA和蛋白，采用Real Time PCR和Western blot方法檢測GFP mRNA和蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.倒置熒光顯微鏡觀察小鼠腹

8、膜組織冰凍切片，與對照組相比，腹腔注射慢病毒小鼠腹膜組織有GFP表達(dá);
　　2.小鼠腹膜組織石蠟切片HE、Masson染色觀察(.)與對照組相比，腹腔注射慢病毒小鼠腹膜組織形態(tài)學(xué)無明顯改變;
　　3.Real Time PCR和western blot的方法檢測，腹腔注射慢病毒小鼠腹膜組織有GFP mRNA和蛋白表達(dá);
　　4.使用2×108GTU LV-GFP組的轉(zhuǎn)染效率高于()108GTU LV-GFP組，而與3×

9、108GTU LV-GFP組轉(zhuǎn)染效率差異不大。
　　結(jié)論：
　　腹腔注射慢病毒能安全有效轉(zhuǎn)染小鼠腹膜組織，2×108GTU為最佳效應(yīng)滴度。
　　第二章miRNA-302c在腹膜透析小鼠腹膜間皮細(xì)胞EMT中的作用與機(jī)制
　　目的：利用慢病毒載體將miRNA-302c導(dǎo)入PD小鼠腹膜組織，研究miRNA-302c在PD小鼠腹膜間皮細(xì)胞EMT中的作用與機(jī)制。
　　方法：12周齡ICR雄性小鼠，體重28-30克。隨

10、機(jī)分為空白對照組(n=5):腹腔注射1.5ml0.9％生理鹽水，每天一次×28天;PDF組(n=5):腹腔注射1.5ml含4.25％葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)腹透液，每天一次×28天;LV-mmu-miRNA-302c+PDF組(n=5):腹腔注射1.5ml含2×108GTU的LV-mmu-miRNA-302c，第三天開始腹腔注射1.5ml含4.25％葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)腹膜透析液，每天一次×28天;LV-pGIPZ+PDF組:腹腔注射1.5ml含2×108

11、GTU的LV-pGIPZ，第三天開始腹腔注射1.5ml含4.25％葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)腹膜透析液，每天一次×28天。于第28天處死小鼠，壁層腹膜用于制作石蠟切片HE和Masson染色觀察腹膜形態(tài)變化、冰凍切片觀察GFP表達(dá)，臟層腹膜用于提取組織蛋白和mRNA，并采用Weste(rn)-blot、Real Time-PCR等方法檢測miRNA-302c、E-cadherin、α-SMA、collagenⅠ、CTGF的表達(dá)。
　　結(jié)果：

12、>　　1.小鼠腹膜組織石蠟切片HE、Masson染色觀察，與空白對照組相比，PDF組小鼠腹膜組織可見EMT的形態(tài)變化，而LV-mmu-miR-302c+PDF組腹膜組織形態(tài)學(xué)變化介于空白對照組和PDF組之間，EMT改變較PDF組減輕;
　　2.TaqMan探針實(shí)時熒光定量Real Time PCR檢測發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，腹腔注射4.25％PDF的各組小鼠臟層腹膜組織miRNA-302c表達(dá)均有下調(diào)，LV-mmu-miR-302

13、c+PDF組較PDF組miRNA-302c表達(dá)增高;
　　3.Real Time PCR、western blot證實(shí)每天腹腔注射4.25％PDF1.5ml，連續(xù)28天，可引起小鼠腹膜組織EMT，E-cadherin表達(dá)減少，α-SMA及collagenⅠ表達(dá)增高。而LV-mmu-miR-302c轉(zhuǎn)染上調(diào)miRNA-302c可抑制腹透小鼠腹膜組織α-SMA、collagenⅠ表達(dá)增加，E-cadherin表達(dá)降低;與空白對照組相比

14、，各組腹透小鼠腹膜組織CTGF表達(dá)均有上調(diào)，LV-mmu-miR-302c+PDF組較PDF組CTGF表達(dá)降低。
　　結(jié)論：
　　高糖腹透液可引起小鼠腹膜間皮細(xì)胞EMT; LV-(m)mu-miR-302c可有效轉(zhuǎn)染小鼠腹膜上調(diào)miRNA-302c的表達(dá)，抑制CTGF表達(dá)，減輕腹透小鼠腹膜間皮細(xì)胞EMT。
　　第三章 miRNA-302c調(diào)控TGF-β1誘導(dǎo)的腹膜間皮細(xì)胞EMT形成的機(jī)理
　　目的：通過觀察慢病毒

15、介導(dǎo)的miRNA-302c對TGF-β1誘導(dǎo)人腹膜間皮細(xì)胞(human peritoneal mesothelial cells，HPMCs) EMT過程中CTGF表達(dá)的影響，探討miRNA-302c調(diào)控TGF-β1誘導(dǎo)的HPMCsEMT形成的機(jī)制。
　　方法：常規(guī)培養(yǎng)正常HPMCs，隨機(jī)分為:空白對照組:不加任何干預(yù);TGF-β1組:用5ng/mlTGF-β1刺激48小時;LV-hsa-miR-302c+TGF-β1組:轉(zhuǎn)染載有

16、miRNA-302c的慢病毒LV-hsa-miR-302c后，用5ng/mlTGF-β1刺激48小時;LV-pGIPZ+TGF-β1組:轉(zhuǎn)染載有對照質(zhì)粒pGIPZ的慢病毒LV-pGIPZ后，用5ng/mlTGF-β1刺激48小時。采用熒光顯微鏡觀察GFP熒光蛋白表達(dá)以判斷病毒轉(zhuǎn)染效率。采用Western-blot、Real Time-PCR等方法分別檢測miRNA-302c、E-cadherin、α-SMA、collagenⅠ、CTGF

17、等在HPMCs中的表達(dá)變化及其相互關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　1.TaqMan探針實(shí)時熒光定量Real Time PCR檢測發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，TGF-β1刺激的各組腹膜間皮細(xì)胞miRNA-302c表達(dá)均有下調(diào)，LV-hsa-miR-302c+TGF-β1組miRNA-302c表達(dá)較TGF-β1組增高;
　　2.HPMCs經(jīng)5ng/ml TGF-β1刺激48小時后，細(xì)胞出現(xiàn)成纖維樣細(xì)胞形態(tài)改變，而LV-hsa-miR-

18、302c+TGF-β1組細(xì)胞形態(tài)變化介于空(白)對照組和TGF-β1組之間，細(xì)胞EMT形態(tài)改變較TGF-β1組減輕;
　　3.Real TimePCR、western blot證實(shí)5ng/ml TGF-β1刺激48h可引起HPMCsEMT，E-cadherin表達(dá)減少，α-SMA及collagenⅠ表達(dá)增高;而LV-hsa-miR-302c轉(zhuǎn)染上調(diào)miR-302c可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的α-SMA、collagenⅠ表達(dá)增加，E-