肝癌中的HBV因素與抗DKK1單克隆抗體的放射免疫顯像.pdf

1、乙型肝炎病毒(HBV)感染是亞洲地區(qū)肝癌患者最常見(jiàn)的致病因素。根據(jù)HBV DNA全基因組序列的差異大于8％可將HBV分為A、B、C、D、E、F、G和H共8個(gè)基因型。HBV基因型分布具有地域性和種族性差異，亞洲地區(qū)以B型和C型為主。根據(jù)HBV DNA全基因組序列的差異還可將B和C分為基因亞型B卜B5和基因亞型Cl-C5。研究證實(shí)亞洲地區(qū)HBV基因核心啟動(dòng)子(CP，corepromoter)區(qū)突變與肝癌發(fā)生的高風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)。攜帶HBV的肝癌

2、病人中CP區(qū)常見(jiàn)A17621、和G1764A突變。很多因素導(dǎo)致HBV攜帶者有較高的發(fā)生肝癌的風(fēng)險(xiǎn)，因此深入研究HBV基因型、亞型和CP區(qū)突變對(duì)了解HBV對(duì)肝癌的影響有重要意義。 我們用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增HBV DNA序列，分析了乙型肝炎病毒陽(yáng)性的原發(fā)性肝癌組織標(biāo)本80例，其中廣西地區(qū)20例，上海、浙江、江蘇(長(zhǎng)三角地區(qū))60例。PCR產(chǎn)物直接純化測(cè)序。用NCBI在線的軟件viral genotyping tool確定HB

3、V的基因型，MEGA(Moleeular Evolutionary Genetics Analysis，version3.1)軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)和進(jìn)行亞型分型及突變分析。 80例肝癌標(biāo)本中，17例為B基因型(21.3％)，57例為C基因型(71.3％)，6例為B、C基因型混合感染(7.5％)。對(duì)17例B基因型和57例C基因型的亞型分型，其中B基因型的亞型全都為B2型，C基因型的亞型有Cl、C2和C5等三型，其中有12例為C1型(

4、21.1％)，44例為C2型(77.2％)，1例為C5型(1.8％)。廣西地區(qū)的C1亞型35％(7/20)明顯高于長(zhǎng)三角地區(qū)的C1亞型8.5％(5/60)，而廣西地區(qū)的C2亞型20％(4/20)明顯低于長(zhǎng)三角地區(qū)的C2亞型66.7％(40/60)。兩地區(qū)的HBV基因亞型分布在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著差異。比較兩地區(qū)的HBV序列還發(fā)現(xiàn)，廣西地區(qū)B基因型CP區(qū)T1762/A1764呈現(xiàn)更高的突變性，有6例(100％)存在突變，而長(zhǎng)三角地區(qū)只有2例(1

5、6.7％)。兩地區(qū)原發(fā)性肝癌患者的HBV亞型分布和基因型B的CP區(qū)T1762/A1764突變率有顯著差異。在肝癌的發(fā)生過(guò)程中，肝癌的家族聚集現(xiàn)象包括肝癌的高發(fā)家族屢見(jiàn)不鮮。被認(rèn)為是肝癌最重要的相關(guān)病因之一的乙型肝炎病毒，也具有家族聚集現(xiàn)象。家系調(diào)查表明，感染HBV的家系，可以呈現(xiàn)攜帶病毒的常染色體隱性遺傳。因此深入研究肝癌的家族聚集與乙型肝炎病毒的家族聚集的關(guān)系具有重要意義。本研究對(duì)一肝癌的高發(fā)家族進(jìn)行了采樣，研究了其HBV基因型和白細(xì)

6、胞中的HBV整合情況，研究表明在家族成員中的白細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)HBV-DNA整合，HBV的基因亞型為B2犁。 放射免疫顯像是一種有良好應(yīng)用前景的腫瘤診療手段，可以識(shí)別特異的抗原來(lái)區(qū)分正常組織和癌組織。重組單克隆抗體的迅速發(fā)展和應(yīng)用，成為腫瘤的體內(nèi)靶向的重要工具。Dickkopf homolog 1(DKK1)編碼的蛋白屬于dickkopf家族，是一種分泌性糖蛋白，通過(guò)抑制WNT/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與胚胎發(fā)育的過(guò)程<'[

7、22,23]>。本室前期工作<'[24]>發(fā)現(xiàn)DKK1基因在肝癌的發(fā)生和發(fā)展中表達(dá)上調(diào)。此外，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)在多種人腫瘤細(xì)胞系(如SMMC-7721、A549和U251等)的培養(yǎng)上清中檢測(cè)到DKK1的高表達(dá)。 我們首先建立荷人肝癌裸鼠模型<'[25]>。<'131>I標(biāo)記鼠抗人DKK1單克隆抗體<'[26]，標(biāo)記的抗DKK1抗體經(jīng)尾靜脈注入荷瘤裸鼠體內(nèi)。對(duì)照組注射<'131>I標(biāo)記的正常小鼠免疫球蛋白IgGl。分別在注射后

8、24h、48h、96h和120h行單光子放射斷層掃描顯像(SPECT，single photon emission computed tomography)，觀察瘤體位置的放射性聚集情況。斷頸處死裸鼠取臟器稱濕重并計(jì)數(shù)，測(cè)定裸鼠的移植瘤和肝臟、肺、脾等重要器官單位重量的放射性比值(T/NT)。 我們發(fā)現(xiàn)在注射<'131>I-抗DKK1抗體后120h，瘤體顯像清晰，瘤體部位出現(xiàn)選擇性放射性濃聚。移植瘤和各臟器的T/NT比值維持在較