止痢草油在緩解運(yùn)輸應(yīng)激誘導(dǎo)的腸道氧化損傷中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、生豬運(yùn)輸是豬肉生產(chǎn)過程中不可缺少的組成部分。育肥豬在運(yùn)輸過程中會(huì)出現(xiàn)失重增加、肉品質(zhì)和胴體性狀下降、疾病易感性增強(qiáng)和死亡率升高的現(xiàn)象，降低了動(dòng)物福利，并增加了消費(fèi)者和養(yǎng)殖者的成本負(fù)擔(dān)。止痢草油作為一種具有抗氧化、抗菌和抗炎活性的植物提取物，在本課題組前期的研究中顯示，能通過保護(hù)運(yùn)輸應(yīng)激中育肥豬腸道的氧化損傷，起到緩解運(yùn)輸應(yīng)激的作用。但是止痢草油對(duì)應(yīng)激條件下豬腸道氧化損傷的調(diào)控機(jī)理尚不清楚。本研究從止痢草油緩解腸道氧化損傷的角度出發(fā)，首先

2、通過上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)三個(gè)氧化應(yīng)激模型研究了止痢草油緩解腸道氧化損傷的途徑，并分別從抗氧化酶和氧化酶兩個(gè)方面，探討止痢草油緩解腸道上皮氧化損傷的分子機(jī)制。隨后驗(yàn)證止痢草油緩解育肥豬運(yùn)輸應(yīng)激的作用是通過控制腸道氧化損傷來發(fā)揮效果的。
　　第一部分核轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子（nuclear factor-erythroid2-related factor-2，Nrf2）通過和抗氧化效應(yīng)元件（antioxidant re

3、sponse element，ARE）結(jié)合，上調(diào)ARE相關(guān)抗氧化基因（包括細(xì)胞內(nèi)源性抗氧化蛋白和抗氧化酶），是細(xì)胞內(nèi)調(diào)控抗氧化應(yīng)答的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。止痢草油被報(bào)道具有提高豬腸道抗氧化酶的作用，但作用機(jī)制尚不清楚。本試驗(yàn)，通過豬空腸上皮(IPEC-J2)細(xì)胞，探討止痢草油提高上皮細(xì)胞抗氧化蛋白表達(dá)的具體分子作用機(jī)制。主要結(jié)果如下，止痢草油(2.5-10μg/ml)能夠緩解過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)造成的IPEC

4、-J2細(xì)胞氧化損傷，降低細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)和脂質(zhì)自氧化代謝物(malondialdehyde，MDA)的水平。止痢草油能劑量性增加銅/鋅超氧化物歧化酶(cu/zn-superoxide dismutase，SODl)、谷氨酸半胱氨酸連接酶催化亞基（g-glutamyl cysteine ligase catalytic，GCLC）和谷氨酸半胱氨酸連接酶調(diào)節(jié)亞基（g-glutamyl c

5、ysteine ligase modifier，GLCM）的基因和蛋白水平，同時(shí)增加IPEC-J2細(xì)胞內(nèi)SOD1和GSH的有效濃度。止瘌草油能劑量性增加包含Nrf2的報(bào)告基因活性，提高細(xì)胞內(nèi)Nrf2蛋白和基因水平，同時(shí)促進(jìn)Nrf2由細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核的遷移。當(dāng)IPEC-J2細(xì)胞Nrf2受到Nrf2 siRNA抑制時(shí)，止痢草油提高體內(nèi)抗氧化酶表達(dá)的能力受到明顯抑制，同時(shí)止痢草油抑制H2O2誘導(dǎo)的IPEC-J2氧化損傷能力也受到減弱。
　

6、　第二部分小鼠腹腔巨噬細(xì)胞（RAW264.7）活化對(duì)大鼠回腸上皮細(xì)胞(IEC-18)氧化損傷的影響。構(gòu)建IEC-18細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞共培養(yǎng)體系，通過LPS誘導(dǎo)上皮細(xì)胞-巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)模型，研究菌群紊亂導(dǎo)致腸道氧化損傷的作用途徑，并探討巨噬細(xì)胞活化在上皮細(xì)胞氧化損傷中的作用。結(jié)果顯示:在LPS(10μg/ml)刺激下，RAW264.7降低IEC-18細(xì)胞跨上皮電阻值，提高IEC-18細(xì)胞熒光黃透過率，同時(shí)降低IEC-18細(xì)胞緊密

7、連接蛋白ZO-1和Occludin在基因和蛋白中的表達(dá)，并破壞了IEC-18細(xì)胞緊密連接蛋白的結(jié)構(gòu)。RAW264.7細(xì)胞能增加IEC-18細(xì)胞中ROS和MDA水平，降低谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽(glutathione/striatal oxidized glutathione，GSH/GSSG)比值。RAW264.7細(xì)胞能增加IEC-18細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)，碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色流式細(xì)胞術(shù)分析和原位熒光檢

8、測(cè)進(jìn)一步驗(yàn)證了細(xì)胞凋亡的結(jié)果。NOX2是NADPH氧化酶的催化亞基，轉(zhuǎn)染NOX2 siRNA，RAW264.7細(xì)胞增加共培養(yǎng)體系中活性氧的水平和降低IEC-18細(xì)胞屏障功能的能力受到抑制。
　　第三部分止痢草油對(duì)NADPH氧化酶介導(dǎo)的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的影響。止痢草油可以緩解菌群紊亂誘導(dǎo)的腸道的氧化損傷，但具體作用機(jī)制尚不清楚。本試驗(yàn)以RAW264.7細(xì)胞為模型，研究止痢草油對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響，探討止

9、痢草油抑制RAW264.7細(xì)胞氧化應(yīng)激的可能途徑。止痢草油(2.5-10μg/ml)能夠緩解過LPS(10μg/ml)造成的RAW264.7細(xì)胞氧化損傷，降低細(xì)胞內(nèi)ROS和MDA的水平，提高GSH/GSSG的比值。止痢草油能降低LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NF-κdB(p65)在RAW264.7細(xì)胞核內(nèi)的富集，減少RAW264.7細(xì)胞炎性因子的分泌，同時(shí)抑制炎性因子基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)染NOX2 siRNA，當(dāng)RAW264.7細(xì)胞NOX2

10、受到抑制時(shí)，LPS促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞ROS產(chǎn)生和炎癥因子mRNA表達(dá)的作用受到抑制。止痢草油能夠抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NADPH氧化酶的激活，降低NOX2基因和蛋白表達(dá)水平。
　　第四部分止痢草油緩解育肥豬運(yùn)輸應(yīng)激和改善腸道的效果。同時(shí)評(píng)估止痢草油對(duì)育肥后期豬生長性能的作用。本試驗(yàn)試驗(yàn)選擇255頭商品豬，分為3組，即對(duì)照組、維生素E組(200mg/kg)和止痢草油組（25mg/kg）。飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后，每組選擇3

11、6頭體重接近的育肥豬做5小時(shí)運(yùn)輸應(yīng)激處理。結(jié)果顯示:在運(yùn)輸應(yīng)激條件下，維生素E對(duì)腸道沒有保護(hù)作用，而止痢草油能提高育肥豬腸道絨毛高度，維持腸道絨毛的完整，同時(shí)止痢草油增加腸道緊密連接蛋白閉鎖小帶蛋白（zonula occludens-1，ZO-1）和封閉蛋白(Occludin)的基因和蛋白表達(dá)，并降低血清中內(nèi)毒素的水平。止痢草油對(duì)育肥豬空腸、回腸和結(jié)腸中總菌落、糞腸球菌屬和乳酸桿菌屬的數(shù)量沒有影響。但是止痢草油能降低空腸、回腸和結(jié)腸中大

12、腸桿菌的數(shù)量。止痢草油能降低育肥豬空腸中氧化應(yīng)激標(biāo)志物ROS和MDA的水平，同時(shí)提高抗氧化酶T-SOD的水平。在運(yùn)輸應(yīng)激狀態(tài)下，和對(duì)照組相比，止痢草油組能降低育肥豬運(yùn)輸失重率，并提高育肥豬胴體重和屠宰率。與對(duì)照組相比，不同抗氧化劑組均能提高背最長肌45min pH和24h色值。止痢草油組與對(duì)照組相比，能顯著降低滴水損失，而維生素E組對(duì)滴水損失沒有影響。不同抗氧化劑組和對(duì)照組相比，均能降低育肥豬體內(nèi)ROS和MDA的水平，而和維生素E組相比

13、，止痢草油組抗氧化效果更好。與對(duì)照組相比，止痢草油組具有提高谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，Gpx)和總超氧化物歧化酶活性(total superoxide dismutase，T-SOD)的作用，但是維生素E組對(duì)提高抗氧化酶活性沒有影響。此外，同對(duì)照相組比，止痢草油組提高豬育肥后期平均日增重，同時(shí)止痢草油組具有降低降低料肉比的作用。
　　本研究主要結(jié)論:(1)止痢草油能提高腸道上皮細(xì)胞抗氧化能力

14、，其機(jī)制包括兩個(gè)方面:第一，2.5-10μg/ml止痢草油通過激活I(lǐng)PEC-J2細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Nrf2，提高了細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶SOD1和GSH的表達(dá)。第二，巨噬細(xì)胞活化產(chǎn)生的活性氧是誘導(dǎo)上皮細(xì)胞氧化損傷的重要原因。在LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激的模型中，2.5-10μg/ml止痢草油抑制了NADPH氧化酶的表達(dá)，降低活性氧的產(chǎn)生。(2)宰前28天育肥豬日糧中添加25mg/kg止痢草油，能提高育肥豬生長性能，同時(shí)改善育肥豬運(yùn)輸應(yīng)