止痢草油在緩解運輸應激誘導的腸道氧化損傷中的作用及機制研究.pdf

1、生豬運輸是豬肉生產(chǎn)過程中不可缺少的組成部分。育肥豬在運輸過程中會出現(xiàn)失重增加、肉品質(zhì)和胴體性狀下降、疾病易感性增強和死亡率升高的現(xiàn)象，降低了動物福利，并增加了消費者和養(yǎng)殖者的成本負擔。止痢草油作為一種具有抗氧化、抗菌和抗炎活性的植物提取物，在本課題組前期的研究中顯示，能通過保護運輸應激中育肥豬腸道的氧化損傷，起到緩解運輸應激的作用。但是止痢草油對應激條件下豬腸道氧化損傷的調(diào)控機理尚不清楚。本研究從止痢草油緩解腸道氧化損傷的角度出發(fā)，首先

2、通過上皮細胞、巨噬細胞以及上皮細胞和巨噬細胞共培養(yǎng)三個氧化應激模型研究了止痢草油緩解腸道氧化損傷的途徑，并分別從抗氧化酶和氧化酶兩個方面，探討止痢草油緩解腸道上皮氧化損傷的分子機制。隨后驗證止痢草油緩解育肥豬運輸應激的作用是通過控制腸道氧化損傷來發(fā)揮效果的。
　　第一部分核轉錄相關因子（nuclear factor-erythroid2-related factor-2，Nrf2）通過和抗氧化效應元件（antioxidant re

3、sponse element，ARE）結合，上調(diào)ARE相關抗氧化基因（包括細胞內(nèi)源性抗氧化蛋白和抗氧化酶），是細胞內(nèi)調(diào)控抗氧化應答的關鍵轉錄因子。止痢草油被報道具有提高豬腸道抗氧化酶的作用，但作用機制尚不清楚。本試驗，通過豬空腸上皮(IPEC-J2)細胞，探討止痢草油提高上皮細胞抗氧化蛋白表達的具體分子作用機制。主要結果如下，止痢草油(2.5-10μg/ml)能夠緩解過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)造成的IPEC

4、-J2細胞氧化損傷，降低細胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)和脂質(zhì)自氧化代謝物(malondialdehyde，MDA)的水平。止痢草油能劑量性增加銅/鋅超氧化物歧化酶(cu/zn-superoxide dismutase，SODl)、谷氨酸半胱氨酸連接酶催化亞基（g-glutamyl cysteine ligase catalytic，GCLC）和谷氨酸半胱氨酸連接酶調(diào)節(jié)亞基（g-glutamyl c

5、ysteine ligase modifier，GLCM）的基因和蛋白水平，同時增加IPEC-J2細胞內(nèi)SOD1和GSH的有效濃度。止瘌草油能劑量性增加包含Nrf2的報告基因活性，提高細胞內(nèi)Nrf2蛋白和基因水平，同時促進Nrf2由細胞質(zhì)向細胞核的遷移。當IPEC-J2細胞Nrf2受到Nrf2 siRNA抑制時，止痢草油提高體內(nèi)抗氧化酶表達的能力受到明顯抑制，同時止痢草油抑制H2O2誘導的IPEC-J2氧化損傷能力也受到減弱。
　

6、　第二部分小鼠腹腔巨噬細胞（RAW264.7）活化對大鼠回腸上皮細胞(IEC-18)氧化損傷的影響。構建IEC-18細胞和RAW264.7細胞共培養(yǎng)體系，通過LPS誘導上皮細胞-巨噬細胞共培養(yǎng)模型，研究菌群紊亂導致腸道氧化損傷的作用途徑，并探討巨噬細胞活化在上皮細胞氧化損傷中的作用。結果顯示:在LPS(10μg/ml)刺激下，RAW264.7降低IEC-18細胞跨上皮電阻值，提高IEC-18細胞熒光黃透過率，同時降低IEC-18細胞緊密

7、連接蛋白ZO-1和Occludin在基因和蛋白中的表達，并破壞了IEC-18細胞緊密連接蛋白的結構。RAW264.7細胞能增加IEC-18細胞中ROS和MDA水平，降低谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽(glutathione/striatal oxidized glutathione，GSH/GSSG)比值。RAW264.7細胞能增加IEC-18細胞凋亡蛋白的表達，碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色流式細胞術分析和原位熒光檢

8、測進一步驗證了細胞凋亡的結果。NOX2是NADPH氧化酶的催化亞基，轉染NOX2 siRNA，RAW264.7細胞增加共培養(yǎng)體系中活性氧的水平和降低IEC-18細胞屏障功能的能力受到抑制。
　　第三部分止痢草油對NADPH氧化酶介導的氧化應激和炎癥反應的影響。止痢草油可以緩解菌群紊亂誘導的腸道的氧化損傷，但具體作用機制尚不清楚。本試驗以RAW264.7細胞為模型，研究止痢草油對LPS誘導的RAW264.7細胞氧化應激的影響，探討止

9、痢草油抑制RAW264.7細胞氧化應激的可能途徑。止痢草油(2.5-10μg/ml)能夠緩解過LPS(10μg/ml)造成的RAW264.7細胞氧化損傷，降低細胞內(nèi)ROS和MDA的水平，提高GSH/GSSG的比值。止痢草油能降低LPS誘導的RAW264.7細胞NF-κdB(p65)在RAW264.7細胞核內(nèi)的富集，減少RAW264.7細胞炎性因子的分泌，同時抑制炎性因子基因的表達。轉染NOX2 siRNA，當RAW264.7細胞NOX2

10、受到抑制時，LPS促進RAW264.7細胞ROS產(chǎn)生和炎癥因子mRNA表達的作用受到抑制。止痢草油能夠抑制LPS誘導的RAW264.7細胞NADPH氧化酶的激活，降低NOX2基因和蛋白表達水平。
　　第四部分止痢草油緩解育肥豬運輸應激和改善腸道的效果。同時評估止痢草油對育肥后期豬生長性能的作用。本試驗試驗選擇255頭商品豬，分為3組，即對照組、維生素E組(200mg/kg)和止痢草油組（25mg/kg）。飼養(yǎng)試驗結束后，每組選擇3

11、6頭體重接近的育肥豬做5小時運輸應激處理。結果顯示:在運輸應激條件下，維生素E對腸道沒有保護作用，而止痢草油能提高育肥豬腸道絨毛高度，維持腸道絨毛的完整，同時止痢草油增加腸道緊密連接蛋白閉鎖小帶蛋白（zonula occludens-1，ZO-1）和封閉蛋白(Occludin)的基因和蛋白表達，并降低血清中內(nèi)毒素的水平。止痢草油對育肥豬空腸、回腸和結腸中總菌落、糞腸球菌屬和乳酸桿菌屬的數(shù)量沒有影響。但是止痢草油能降低空腸、回腸和結腸中大

12、腸桿菌的數(shù)量。止痢草油能降低育肥豬空腸中氧化應激標志物ROS和MDA的水平，同時提高抗氧化酶T-SOD的水平。在運輸應激狀態(tài)下，和對照組相比，止痢草油組能降低育肥豬運輸失重率，并提高育肥豬胴體重和屠宰率。與對照組相比，不同抗氧化劑組均能提高背最長肌45min pH和24h色值。止痢草油組與對照組相比，能顯著降低滴水損失，而維生素E組對滴水損失沒有影響。不同抗氧化劑組和對照組相比，均能降低育肥豬體內(nèi)ROS和MDA的水平，而和維生素E組相比

13、，止痢草油組抗氧化效果更好。與對照組相比，止痢草油組具有提高谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，Gpx)和總超氧化物歧化酶活性(total superoxide dismutase，T-SOD)的作用，但是維生素E組對提高抗氧化酶活性沒有影響。此外，同對照相組比，止痢草油組提高豬育肥后期平均日增重，同時止痢草油組具有降低降低料肉比的作用。
　　本研究主要結論:(1)止痢草油能提高腸道上皮細胞抗氧化能力

14、，其機制包括兩個方面:第一，2.5-10μg/ml止痢草油通過激活IPEC-J2細胞轉錄因子Nrf2，提高了細胞內(nèi)抗氧化酶SOD1和GSH的表達。第二，巨噬細胞活化產(chǎn)生的活性氧是誘導上皮細胞氧化損傷的重要原因。在LPS誘導RAW264.7細胞產(chǎn)生氧化應激的模型中，2.5-10μg/ml止痢草油抑制了NADPH氧化酶的表達，降低活性氧的產(chǎn)生。(2)宰前28天育肥豬日糧中添加25mg/kg止痢草油，能提高育肥豬生長性能，同時改善育肥豬運輸應