人淋巴管的體外構(gòu)建研究.pdf

1、背景 國(guó)際淋巴學(xué)會(huì)前主席JR．Casley Smith教授曾指出：“Treatment oflymphedema is a notorious difficulty”，淋巴水腫的治療的卻是一個(gè)世界性的難題，至今尚未找到良好的治療方法，。因此，研究探討淋巴水腫lymphoedema的治療，促進(jìn)淋巴水腫組織內(nèi)的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增生和淋巴管形成lymphngiogenesis，改善淋巴引流途徑，從根本上治療淋巴水腫，已成為擺在淋巴學(xué)工作

2、者面前的極其艱巨而迫切的任務(wù)，具有重大的學(xué)術(shù)理論價(jià)值和和臨床意義。 另一方面，腫瘤tumor的淋巴轉(zhuǎn)移是造成腫瘤病人死亡的主要原因，因此，研究抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移途徑對(duì)控制腫瘤擴(kuò)散也有十分重要的臨床意義。 基于這兩方面的目的，我們?cè)噲D利用干細(xì)胞stem cells首先在體外構(gòu)建人淋巴管，進(jìn)而在此基礎(chǔ)上開展淋巴水腫的治療研究和阻斷腫瘤轉(zhuǎn)移途徑的研究。 1981年．Evans等首次成功地分離培養(yǎng)出小鼠胚胎干細(xì)胞embryo

3、nic stem cell；1998年，Thomson等首次培養(yǎng)出人的胚胎干細(xì)胞；從而為器官、組織移植的長(zhǎng)遠(yuǎn)目標(biāo)打下良好基礎(chǔ)。 繼而成體干細(xì)胞可以分化成多種干細(xì)胞，特別是骨髓內(nèi)含有多能干細(xì)胞，又稱為骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem Cell)。這種干細(xì)胞有許多優(yōu)點(diǎn)：易于從自身取材，無免疫排斥反應(yīng)之憂，因而也就更易為病人所接受；成體干細(xì)胞，涉及較少倫理問題；體外易于擴(kuò)增、易分離、以及體外操作簡(jiǎn)便。因此，在組織器官缺

4、損性疾病，組織器官退行性疾病，遺傳缺陷性疾病等多方面有重要的應(yīng)用前景。 目前的研究表明VEGF-C具有多種生物學(xué)特性和功能，可廣泛作用于血管、淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞。VEGF-C156s是一種點(diǎn)突變型VEGF-C,其同源二聚體只能激活VEGFR-3，不能與VEGFR-2結(jié)合，因此，選用VEGF-C156s對(duì)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化成淋巴管樣內(nèi)皮是最佳的方案，然而必須探討、確定誘導(dǎo)分化的最佳VEGF-C156s濃度和時(shí)間，這也必定涉及到

5、大量的試驗(yàn)。 目的 1．分離、培養(yǎng)出具有一定的純度的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞，并且用流式細(xì)胞儀flow cytometry檢測(cè)純化后細(xì)胞的表面抗體surface-antibody進(jìn)行鑒定 appraisement，為后續(xù)試驗(yàn)做好細(xì)胞儲(chǔ)備。 2．用VEGF-C156s對(duì)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化，確定誘導(dǎo)分化的最佳VEGF-C156s濃度和時(shí)間。 3．研究骨髓間質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)后形成的內(nèi)皮細(xì)胞在三維基質(zhì)中形成管狀結(jié)構(gòu)的能

6、力，對(duì)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞來源淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的功能進(jìn)行檢測(cè)，在體外構(gòu)建新生淋巴管。 材料和方法 1．用密度為1.073g/ml的淋巴細(xì)胞分離液以及貼壁培養(yǎng)分離骨髓間質(zhì)干細(xì)胞，培養(yǎng)、傳代并凍存儲(chǔ)備細(xì)胞。然后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)純化后細(xì)胞的表面抗體CD14，CD34，CD44，CD105和CD166進(jìn)行鑒定。 2．在24孔板中用不同濃度的VEGF-C156s對(duì)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化，然后分別在不同的時(shí)間對(duì)誘導(dǎo)分化后的骨髓間

7、質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行Ⅷ因子染色(內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物)，LYVE-1染色(淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物)鑒定，觀測(cè)染色后陽性細(xì)胞比例，確定誘導(dǎo)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞分化的最佳VEGF-C156s濃度，同時(shí)確定誘導(dǎo)分化時(shí)間，為實(shí)際應(yīng)用中的濃度和時(shí)間打下參考基礎(chǔ)。 3.在冰盒上制備膠原凝膠，然后置培養(yǎng)箱中37℃中使其凝固成為膠原凝膠。選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞吹打成單細(xì)胞懸液，然后接種在膠原凝膠表面。選取3，6，9，12天的膠原塊，用倒置相差顯微鏡從底面觀取表面單層

8、細(xì)胞之下的不同平面，同時(shí)從垂直斷面觀察并照相。 結(jié)果 1．通過淋巴細(xì)胞分離液以及貼壁培養(yǎng)分離的方法，得到骨髓間質(zhì)干細(xì)胞。到第三代以后，雜細(xì)胞甚少。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗體，CD44，CD105和CD166呈陽性，CD14和CD34呈陰性。 2．用50ng/ml濃度的VEGF-C156s誘導(dǎo)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞，在第5天開始出現(xiàn)Ⅷ因子染色陽性細(xì)胞，10天后，幾乎所有的細(xì)胞都Ⅷ因子染色陽性。50ng/ml濃度組和100

9、ng/ml濃度組差異不大，而10ng/ml和20ng/ml組VEGF-C156s誘導(dǎo)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞后，效果不明顯，10天后，染色陽性細(xì)胞不多。所以選擇50ng/ml的VEGF-C156s濃度作為最佳誘導(dǎo)濃度。 3．誘導(dǎo)后形成的內(nèi)皮細(xì)胞在三維基質(zhì)中形成管狀結(jié)構(gòu)，我們成功地在體外用骨髓間質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化后構(gòu)建了人淋巴管。 結(jié)論 1．成功分離培養(yǎng)出具有一定的純度的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞，并且進(jìn)行了用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗體進(jìn)