肌細(xì)胞增強(qiáng)因子-2與中國(guó)北方漢族人群冠心病的相關(guān)性研究.pdf

1、研究背景及研究目的: 心血管疾病是當(dāng)今世界威脅人類健康最嚴(yán)重的疾病之一，其發(fā)病率和死亡率均超過(guò)腫瘤性疾病而躍居第一。其主要的表現(xiàn)形式包括冠心病(CHD)、心肌梗死(MI)、充血性心力衰竭、先天性心臟病等。目前認(rèn)為，心血管疾病的發(fā)生與各種環(huán)境因素(諸如性別、年齡、血壓、血脂和糖尿病)和遺傳因素密切相關(guān)。雖然對(duì)于心血管疾病發(fā)生的病理學(xué)機(jī)制還不十分清楚，但是流行病學(xué)調(diào)查和雙胞胎遺傳背景的研究都已經(jīng)充分肯定了遺傳學(xué)因素在心血管疾病中的關(guān)

2、鍵作用。通過(guò)對(duì)MONICA 監(jiān)測(cè)區(qū)域冠心病發(fā)生的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果分析，我國(guó)北方地區(qū)冠心病發(fā)病率和死亡率位居全國(guó)首位。因此，對(duì)中國(guó)北方漢族人群冠心病易感基因的研究對(duì)這一疾病的防治策略將具有重要意義。 早期的研究工作主要集中在冠心病高危風(fēng)險(xiǎn)因素相關(guān)基因的研究上，如血脂代謝、凝血和纖溶系統(tǒng)、血小板膜受體基因等。但迄今為止，這方面研究中仍未發(fā)現(xiàn)與冠心病發(fā)生直接相關(guān)的致病基因。近年來(lái)，人類基因組圖譜的繪制完成和單核苷酸多態(tài)性(SNP)第

3、三代遺傳學(xué)標(biāo)記的出現(xiàn)，使得通過(guò)全基因組水平進(jìn)行遺傳連鎖分析，定位多基因遺傳性疾病易感基因的研究工作成為可能。近年來(lái)，在冠心病易感基因研究領(lǐng)域中也取得了一些令人矚目的突破性進(jìn)展。2000 年以后，在芬蘭人、印度人、墨西哥裔美國(guó)人中，幾個(gè)大規(guī)模冠心病遺傳易感基因的全基因組掃描工作被先后完成。綜合分析這些研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，某些易感位點(diǎn)上的定位結(jié)果具有一致性，主要集中在第1、3、6、9、14 號(hào)等染色體片段，但具體的易感基因位點(diǎn)尚未最終確定。200

4、3 年，王擎博士在美國(guó)白人冠心病遺傳家系中發(fā)現(xiàn)冠心病的致病基因是肌細(xì)胞增強(qiáng)因子-2 基因(Myocyte Enhancer Factor-2, MEF2A)，其在冠心病患者中的突變方式是第11 外顯子的21 個(gè)堿基的缺失突變。細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)研究顯示，這種缺失突變通過(guò)負(fù)顯性效應(yīng)機(jī)制影響轉(zhuǎn)錄因子MEF2A 基因在細(xì)胞核中的定位，同時(shí)降低MEF2A 的轉(zhuǎn)錄水平及蛋白質(zhì)合成。隨后此研究組在冠心病的散發(fā)人群MEF2A 基因第7 外顯子上又發(fā)現(xiàn)了3

5、種致病的點(diǎn)突變(N263S，P279L，G283D)，以上研究進(jìn)一步證實(shí)了MEF2A 基因是冠心病的致病基因。 人們最初發(fā)現(xiàn)MEF2A 是一種富含AT 序列的特異性肌細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控多種骨骼肌和心肌細(xì)胞特異性基因的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄。MFE2 超家族包含4種同源蛋白，MEF2A、MEF2B、MEF2C、MEF2D。MEF2A 基因定位于染色體15q26，由499 個(gè)氨基酸組成，屬于MADS 框轉(zhuǎn)錄家族，N 端的保守序列具有MADS

6、結(jié)構(gòu)域和MEF2A 結(jié)構(gòu)域，能夠與其他轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合形成二聚體并具有DNA 結(jié)合活性；C 末端的磷酸化位點(diǎn)是多種激酶的靶點(diǎn)，與啟動(dòng)基因表達(dá)有關(guān)，是MEF2A 因子活性調(diào)節(jié)及發(fā)揮功能的主要區(qū)域。MEF2A 基因位于多種肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞特異性基因信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的下游，能夠激活多種結(jié)構(gòu)蛋白。MEF2A 基因敲除小鼠出生后表現(xiàn)出右心室擴(kuò)張，肌細(xì)胞線粒體排列紊亂，并有發(fā)生猝死的可能。而MEF2C 缺陷小鼠則難以形成正常的心臟及脈管系統(tǒng)。因此，MEF2

7、 在調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞增殖、內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)育和維持血管結(jié)構(gòu)完整性中發(fā)揮著重要作用。由于MEF2A 與心血管系統(tǒng)疾病的關(guān)系仍然是目前爭(zhēng)論的焦點(diǎn)，為了明確MEF2A 基因與中國(guó)北方漢族人群冠心病發(fā)生的相關(guān)關(guān)系，我們進(jìn)行了此項(xiàng)病例對(duì)照研究。 研究對(duì)象和研究方法: 1. 研究對(duì)象:從2003 年11 月至2006 年5 月，共入選726 例在沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院心內(nèi)科行冠狀動(dòng)脈造影的病人作為研究對(duì)象。其中男性492 例，女性234 例，

8、平均年齡57.2±10.5 歲。所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。本實(shí)驗(yàn)由醫(yī)院道德倫理委員會(huì)批準(zhǔn)實(shí)施。 2. PCR 擴(kuò)增飽和酚-氯仿法提取基因組DNA，PCR 方法擴(kuò)增目的片段。PCR 引物設(shè)計(jì)由Primer 5.0 軟件包完成。PCR 擴(kuò)增目的片段覆蓋第7 和第11 外顯子中有爭(zhēng)議的突變位點(diǎn)。 3. 第7 外顯子突變位點(diǎn)篩選使用PCR-SSCP 方法，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定PCR 擴(kuò)增的效率、特異性以及變性聚丙烯酰胺凝膠

9、電泳分離單鏈構(gòu)象多態(tài)的靈敏度。對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果中出現(xiàn)的異常片段，需要重復(fù)兩次，然后純化回收測(cè)序，并最終證實(shí)突變的位置和具體形式。 4. 第11 外顯子(CAG)n 等位基因的基因型分析根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)中電泳及測(cè)序結(jié)果，將具有(CAG)的11 次重復(fù)序列作為標(biāo)準(zhǔn)序列，其PCR 產(chǎn)物作為內(nèi)參，與待檢測(cè)樣品的MEF2A 第11 外顯子PCR 產(chǎn)物在15 ％中性聚丙烯酰胺凝膠中，室溫下電泳5 h，300 伏電壓，銀染顯色。 將具有特殊

10、電泳圖形的PCR 產(chǎn)物純化回收，送測(cè)序鑒定。 5. 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用四格表卡方檢驗(yàn)方法計(jì)算病例組和對(duì)照組等位基因的分布頻率，用卡方檢驗(yàn)方法計(jì)算Hardy-Weinberg 平衡分布。Logistic 回歸計(jì)算各種獨(dú)立危險(xiǎn)因素對(duì)冠心病發(fā)病的預(yù)測(cè)價(jià)值，同時(shí)計(jì)算相對(duì)危險(xiǎn)度和95 ％可信區(qū)間。 Jonckheere-Terpstra 趨勢(shì)檢驗(yàn)方法判斷(CAG)n 等位基因與病變血管程度之間的相關(guān)關(guān)系。所有統(tǒng)計(jì)計(jì)算由SPSS13

11、.0 軟件包完成。 結(jié)果: 1. 入選研究對(duì)象基線特征在所入選的726 例中，冠心病組378 人，無(wú)冠心病348 人。比較兩組病人的臨床基線特征，冠心病組在各種常見(jiàn)危險(xiǎn)因素(諸如吸煙、高血壓和糖尿病等)方面均明顯高于對(duì)照組。 2. 第7 外顯子基因突變的研究所有726 例入選研究對(duì)象MEF2A 基因第7 外顯子PCR 擴(kuò)增片段，經(jīng)PCR-SSCP 檢測(cè)后，未發(fā)現(xiàn)致病突變。 3. 第11 外顯子(CA

12、G)n 等位基因的基因型分析(CAG)n 各種等位基因的基因型在人群中的整體分布符合Hardy-Weinberg平衡定律；對(duì)冠心病組和對(duì)照組各種等位基因基因型的分析發(fā)現(xiàn)，(CAG)n=11等位基因在對(duì)照組的分布頻率明顯高于冠心病組(p=0.001)；而(CAG)n=9 等位基因在冠心病組的分布頻率明顯高于對(duì)照組，兩者相比存在顯著性差異(p＝0.000, OR=1.958, 95 ％CI=1.412-2.714)。這一結(jié)果表明，(CAG)

13、n=9 等位基因與冠心病的發(fā)生存在相關(guān)關(guān)系。為了進(jìn)一步判斷(CAG)n=9 等位基因?qū)谛牟〉念A(yù)測(cè)價(jià)值同時(shí)排除由于基線不匹配對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成的影響，應(yīng)用Logistic 回歸分析方法，將(CAG)n=9 等位基因與冠心病常見(jiàn)危險(xiǎn)因素進(jìn)行了綜合比較，發(fā)現(xiàn)(CAG)n=9 等位基因是冠心病發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(p=0.001, oddsratio=1.245, 95 ％CI=1.095-1.417)。根據(jù)冠狀動(dòng)脈造影結(jié)果，分析(CAG)n 等位

14、基因與冠狀動(dòng)脈嚴(yán)重程度之間的相關(guān)關(guān)系，發(fā)現(xiàn)(CAG)n=9 等位基因在對(duì)照組中的分布頻率最低(23.7 ％)，隨病變血管支數(shù)的增加，(CAG)n=9 等位基因在各組中的分布頻率呈遞增趨勢(shì)，在三支血管病變患者中所占比例最高(39.7 ％)，Jonckheere-Terpstra 趨勢(shì)檢驗(yàn)結(jié)果顯示，(CAG)n=9 等位基因與冠狀動(dòng)脈病變血管支數(shù)之間存在相關(guān)關(guān)系。 結(jié)論: MEF2A 基因第11 外顯子(CAG)n 短串重