rAAV-HIF-1α-siRNA聯(lián)合抗壞血酸對人胰腺癌MiaPaC2細胞糖代謝的影響.pdf

1、胰腺癌為高度惡性的乏血管腫瘤，其組織中有高豐度的HIF-1α表達，而HIF-1α在腫瘤細胞缺氧自適應過程中對腫瘤細胞的糖代謝起著重要調(diào)節(jié)作用。因此，以HIF-1α為靶點有望成為治療胰腺癌的有效手段。當前，RNAi技術可以高效、特異性地促使靶基因mRNA的降解，阻斷靶基因的表達，達到基因敲除的效果。而作為基因治療的載體——腺相關病毒(AAV)，因其無致病性、無免疫原性、可感染分裂細胞和非分裂細胞等特點被認為是抗腫瘤基因治療的最理想載體，而

2、抗壞血酸具有促進HIF-1α蛋白降解的作用。 因此，本實驗將以重組腺相關病毒(rAAV)為載體介導以HIF-1α為靶點的siRNA，聯(lián)合抗壞血酸，作用于MiaPaC2人胰腺癌細胞，厭氧培養(yǎng)條件下觀察其對糖代謝反應關鍵酶——葡萄糖轉(zhuǎn)運體-1(G1ut-1)表達的影響，為進一步探討基因聯(lián)合藥物治療胰腺癌提供一些理論依據(jù)。 方法: 1．提取和擴增載體質(zhì)粒pAAV-hrGFP和pAAV-Hl-siRNA-hrGFP及輔助

3、質(zhì)粒 pAAV-RC、pAAV-Helper；應用磷酸鈣沉淀三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK93細胞法包裝 rAAV；提取和純化rAAV并計算其滴度；再應用rAAV轉(zhuǎn)染MiaPaca2人胰腺癌細胞，利用GFP觀察熒光表達判斷轉(zhuǎn)染效果。 2．對于厭氧培養(yǎng)下的MiaPaCa2人胰腺癌細胞，分5組并給予不同處理因素，(①空白對照組、②空載病毒組、③單純抗壞血酸組、④單純rAAV-H1-siRNA-hrGFP組、⑤rAAV-Hl-siRNA-hrGF

4、P聯(lián)合抗壞血酸組)，24和48小時后，應用蛋白印跡法觀察對MiaPaCa2人胰腺癌細胞HIF-1α蛋白表達的影響，應用RT-PCR法和蛋白印跡法分別觀察對MiaPaCa2人胰腺癌細胞Glm-1基因及蛋白表達的影響。 結果: 1．成功包裝了rAAV，其形態(tài)正常、純度滿意、滴度達4×10<'13>particles/ml。將rAAV-HIF-1α-siRNA轉(zhuǎn)染Mi＃aC2人胰腺癌細胞，熒光顯微鏡下可見綠色熒光表達。

5、 2．Western Blot研究發(fā)現(xiàn)，rAAV-HIF-1α-siRNA和L-ascorbate作用于 MiaPaC2細胞24h后，與對照組比，HIF-1α蛋白明顯下降；在聯(lián)合組中， 48h下降更為顯著。應用RT-PCR法檢測各不同處理因素對MiaPaC2人胰腺癌細胞Glut-1 mRNA表達，發(fā)現(xiàn)rAAV-HIF-1α-siRNA和抗壞血酸有抑制MiaPaC2人胰腺癌細胞Glut-1 mRNA表達的作用，與對照組相比，差異有顯著性)

6、，而rAAV_hrGFP對MiaPaC2細胞Glut-1 mRNA的表達無任何影響，且rAAV-HIF-1α-siRNA抑制Glut-1 mRNA的表達在48小時到達高峰，明顯超過其在24小時的作用；應用WestemBlot檢測發(fā)現(xiàn)，rAAV-Hl-siRNA-hrGFP處理組、抗壞血酸處理組及 rAAV-Hl-siRNA-hrGFP聯(lián)合抗壞血酸處理組的Glut-1蛋白的表達，與對照組相比，有顯著性差異；而rAAV-hrGFP組與對照組

7、相比，Glut-1蛋白的表達未見明顯顯著性差異，且24小時Glut-1蛋白的表達便明顯下降，48小時下降更加顯著。 結論: 1．成功包裝rAAV，其形態(tài)、純度及滴度滿意，且能成功的轉(zhuǎn)染MiaPaC2人胰腺癌細胞。 2．rAAV-HIF-1α-siRNA和L-ascorbate都可抑制MiaPaC2細胞HIF-1α蛋白表達，并且其聯(lián)合作用大于其單獨作。rAAV-Hl-siRNA-hrGFP和抗壞血酸都有抑制MiaP