熱缺血再灌注損傷影響肝臟細(xì)胞周期調(diào)控基因的表達(dá)譜聚類(lèi)分析及相關(guān)蛋白研究.pdf

1、隨著器官移植療效的提高，病例數(shù)逐年遞增，移植器官短缺日趨嚴(yán)重。在劈裂式肝移植、活體肝移植尚不成熟，異種移植、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物仍未取得實(shí)質(zhì)性進(jìn)展之前，“邊緣”供體受到越來(lái)越多的重視。在我國(guó)供肝大多來(lái)自無(wú)心跳“邊緣’’供體，供肝切取時(shí)熱缺血再灌注損傷無(wú)法避免；另外，移植物恢復(fù)血流后膽道的溫缺血亦值得關(guān)注。同時(shí)熱缺血再灌注損傷也是肝膽外科手術(shù)各種肝門(mén)血流阻斷法應(yīng)用下相當(dāng)常見(jiàn)的問(wèn)題。 觀察肝臟熱缺血再灌注損傷對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控和組織細(xì)胞再生相關(guān)基

2、因表達(dá)的影響，篩選出與細(xì)胞周期檢查點(diǎn)密切相關(guān)的功能基因及相關(guān)蛋白，以探討熱缺血再灌注損傷的分子機(jī)制；為臨床防治熱缺血再灌注損傷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 本實(shí)驗(yàn)采用成組隨機(jī)對(duì)照的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，利用微陣列芯片和實(shí)時(shí)熒光定量PCR聯(lián)合分析技術(shù)，分析熱缺血再灌注損傷大鼠模型處理后的基因表達(dá)動(dòng)態(tài)變化；按基因表達(dá)的動(dòng)力學(xué)特征對(duì)功能基因進(jìn)行多元變量聚類(lèi)分析。針對(duì)目的蛋白Hsp70、Gadd45a，、Egrl、CyclinDl的westernblot半定量實(shí)

3、驗(yàn)和免疫熒光組織化學(xué)進(jìn)行細(xì)胞定位及時(shí)序研究。 發(fā)現(xiàn)在常溫?zé)崛毖?0min、再灌注1h和24h時(shí)間點(diǎn)，肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞分別有86、410和234條基因上調(diào)其mRNA表達(dá)，下調(diào)的基因分別為136、312和653條。根據(jù)其表達(dá)動(dòng)力學(xué)特征繪制出分級(jí)聚類(lèi)分析樹(shù)形圖。熒光定量RT-PCR擴(kuò)增分析細(xì)胞保護(hù)機(jī)制密切相關(guān)的基因如：Gadd45a，、Egr1、Hsp70，確認(rèn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與芯片檢測(cè)相一致。 Western blot半定量研究顯示Egr1蛋白在

4、熱缺血30m即有高表達(dá)，再灌注30m表達(dá)有所下降。Hsp70蛋白和CyclinD1蛋白在灌注早期保持高表達(dá)狀態(tài)。 免疫熒光染色和western blot蛋白研究方法顯示：Egr1蛋白在熱缺血30m即有高表達(dá)，再灌注30m-1h表達(dá)稍有下降，逐漸下降至處理前水平，符合早期即刻基因的表達(dá)特點(diǎn)。Gadd45a、Hsp70蛋白和CyclinD1蛋白在灌注早期1-3h保持高表達(dá)狀態(tài)。HSP70是細(xì)胞漿陽(yáng)性，N時(shí)陰性，R1h和R2h時(shí)有灶性

5、弱陽(yáng)性，R3h時(shí)強(qiáng)陽(yáng)性，陽(yáng)性細(xì)胞主要在肝小葉中央靜脈血管周?chē)?；Cyclin D1為核陽(yáng)性，N時(shí)即有部分陽(yáng)性，R1-R24h的陽(yáng)性變化不大；Egr-1冰凍切片顯示為核陽(yáng)性，N時(shí)陰性，130'和R30'時(shí)均有個(gè)別細(xì)胞陽(yáng)性，R1h和R2h時(shí)數(shù)量增多，總體陽(yáng)性表達(dá)要稍低于Cyclin D1；GADD45為N(一)，其它均為灶性胞漿陽(yáng)性，只有R1h時(shí)胞漿和核均陽(yáng)性。 顯示在采用非致死性WIRI處理后，再灌注早期肝臟細(xì)胞周期調(diào)控基因相關(guān)基因