黏著斑激酶基因沉默促進(jìn)口腔癌細(xì)胞失巢凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、正常實(shí)體組織細(xì)胞具有錨著依賴性生存(anchor-dependent survival)的特點(diǎn)，在脫黏附狀態(tài)下會(huì)發(fā)生凋亡(細(xì)胞自身控制的程序化死亡)，即失巢凋亡(anoikis)。然而，轉(zhuǎn)移的癌細(xì)胞則具有抗失巢凋亡的生存能力，這也是其發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的生物學(xué)機(jī)制之一。 粘著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)是一種非受體酪氨酸激酶，通過(guò)多種信號(hào)通路在細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)、侵襲、轉(zhuǎn)移、細(xì)胞周期調(diào)控等多方面發(fā)揮了重要作用

2、。FAK在細(xì)胞內(nèi)如細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用、細(xì)胞生長(zhǎng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要的作用。另外，F(xiàn)AK與失巢凋亡密切相關(guān)，盡管其具體機(jī)制還未完全闡述清楚，但已經(jīng)有研究證實(shí)P13K(磷脂酰肌醇-3-激酶)，p130cas，p53和ERK(有絲分裂素激活蛋白激酶)的相互作用在FAK介導(dǎo)的細(xì)胞生存信號(hào)中發(fā)揮重要作用。學(xué)者們通過(guò)人工的方法使多種細(xì)胞株中FAK的表達(dá)增加，結(jié)果顯著抑制細(xì)胞的失巢凋亡，并且賦予細(xì)胞惡性表型。相反，在胃心肌細(xì)胞中，當(dāng)應(yīng)用FAK相

3、關(guān)非激酶使FAK的表達(dá)被抑制時(shí)，黏附依賴的相關(guān)信號(hào)則同時(shí)被抑制。 綜合以上分析，我們提出假設(shè)，F(xiàn)AK基因沉默可能促進(jìn)失巢凋亡，逆轉(zhuǎn)口腔癌細(xì)胞失巢凋亡抗性，進(jìn)而抑制其轉(zhuǎn)移。 第一部分靶向黏著斑激酶siRNA表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)染 目的：構(gòu)建靶向黏著斑激酶(focal adhension kinase， FAK)基因的小干涉RNA(small interfering RNA，siRNA)質(zhì)粒表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染人舌癌細(xì)胞Tca

4、8113后觀察其對(duì)AK表達(dá)的抑制作用。 方法：將靶向黏著斑激酶siRNA表達(dá)載體重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至Tca8113細(xì)胞中，經(jīng)G418抗性篩選，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系；運(yùn)用熒光顯微鏡、免疫細(xì)胞化學(xué)和Western-blot鑒定FAK的沉默效應(yīng)。 結(jié)果：質(zhì)粒酶切證實(shí)目的寡核苷酸片段已被克隆到pGC-SilencerTM-U6/Neo載體中；熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染細(xì)胞；免疫細(xì)胞化學(xué)和Western-blot結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染靶

5、向黏著斑激酶siRNA表達(dá)載體后，F(xiàn)AK基因的表達(dá)受到明顯抑制。 結(jié)論：成功構(gòu)建了針對(duì)人FAK的干擾重組質(zhì)粒，通過(guò)轉(zhuǎn)染Tca8113細(xì)胞可有效地抑制Tca8113細(xì)胞中FAK的表達(dá)。 第二部分 FAK基因沉默對(duì)口腔癌細(xì)胞失巢凋亡抗性的影響 目的：觀察黏著斑激酶(focal adhension kinase，F(xiàn)AK)基因沉默對(duì)口腔舌癌細(xì)胞株Tca8113失巢凋亡抗性的影響，探討FAK基因與口腔鱗癌轉(zhuǎn)移特性的關(guān)系。

6、 方法：以舌癌細(xì)胞株Tca8113為研究對(duì)象，將FAK基因沉默前后的細(xì)胞分別在普通單層貼壁和懸浮條件下培養(yǎng)，24小時(shí)后，流式細(xì)胞儀觀察FAK對(duì)口腔舌癌細(xì)胞株Tca8113體外培養(yǎng)過(guò)程抗失巢凋亡的影響。 結(jié)果：舌癌細(xì)胞株Tca8113體外培養(yǎng)過(guò)程中具有較強(qiáng)的抗失巢凋亡特性。特異性siRNA可以抑制FAK基因的表達(dá)。FAK基因干擾后，Tca8113細(xì)胞的失巢凋亡顯著提高(P＜0.01)。 結(jié)論： FAK基因沉默可以逆轉(zhuǎn)