海綿來(lái)源化合物BA抗肝癌的效應(yīng)及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　海綿來(lái)源化合物BA是一個(gè)具有全新化學(xué)骨架結(jié)構(gòu)的抗腫瘤先導(dǎo)化合物，但是其體內(nèi)外抗肝癌生物學(xué)效應(yīng)及作用機(jī)制尚不明確。本研究以人肝癌細(xì)胞和裸鼠肝癌移植瘤模型為研究對(duì)象，分析海綿來(lái)源化合物BA抑制細(xì)胞增殖、遷移、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及其作用機(jī)制，并探討B(tài)A在裸鼠肝癌模型中的抗肝癌效應(yīng)及其作用機(jī)制。
　　方法：
　　1、體外研究:①BA抑制細(xì)胞增殖的效應(yīng):MTT比色法檢測(cè)BA對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721、Huh-7和Hep

2、G2，正常肝細(xì)胞L02增殖的影響;②BA抑制細(xì)胞遷移的效應(yīng):Transwell法檢測(cè)BA對(duì)SMMC-7721細(xì)胞的遷移能力;③BA誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的效應(yīng):H&E染色法鑒定BA誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞凋亡形態(tài)的變化，熒光倒置顯微鏡與流式細(xì)胞術(shù)AnnexinⅤ-FITC/PI法分析BA誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞凋亡作用;Western Blot法檢測(cè)凋亡蛋白Caspase3和Caspase9的表達(dá)變化;④BA抑制細(xì)胞增殖、遷移并誘導(dǎo)凋亡的作用

3、機(jī)制:Western Blot法檢測(cè)BA及BA聯(lián)用LY294002或IGF-1對(duì)SMMC-7721細(xì)胞中PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。
　　2、體內(nèi)研究:①裸鼠肝癌模型的建立:采用1.0×108/ml肝癌SMMC-7721細(xì)胞懸液，于裸鼠右腋皮下接種0.1ml，建立肝癌裸鼠模型;②藥物干預(yù):裸鼠腫瘤生長(zhǎng)至100-150mm3左右，將裸鼠分為4組，以空白溶媒組、5mg/kg和10mg/kg化合物BA組以及10mg/kg

4、5-FU組連續(xù)5天腹腔注射給藥;③檢測(cè)指標(biāo):監(jiān)測(cè)裸鼠腫瘤大小，計(jì)算抑瘤率，評(píng)價(jià)化合物BA體內(nèi)抑制肝癌效應(yīng);記錄裸鼠的體重，研究BA對(duì)裸鼠生存質(zhì)量的影響;眼球取血檢測(cè)裸鼠肝腎功能;取腫瘤組織以及裸鼠各臟器組織，H&E染色觀察肝癌和臟器組織形態(tài)變化;④BA體內(nèi)抗肝癌的作用機(jī)制:采用免疫組化和Western Blot法分析BA對(duì)腫瘤組織中PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響。
　　結(jié)果：
　　1、化合物BA的體外抗肝癌效應(yīng)

5、>　?、貰A抑制細(xì)胞增殖的效應(yīng):BA能夠抑制系列肝癌細(xì)胞株與正常肝細(xì)胞L02的增殖，且抑制SMMC-7721細(xì)胞增殖呈濃度與時(shí)間依賴性關(guān)系(p＜0.05）。②BA抑制細(xì)胞遷移的效應(yīng):經(jīng)BA處理的SMMC-7721細(xì)胞的遷移數(shù)低于未經(jīng)BA處理的SMMC-7721細(xì)胞組（P＜0.05）。③BA誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的效應(yīng):BA具有誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞發(fā)生凋亡的作用，16μmol/L的BA作用24h后誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率達(dá)32.39％; BA對(duì)凋亡蛋白

6、Caspase3和Caspase9表達(dá)改變:在SMMC-7721細(xì)胞中，與空白組相比，BA能呈濃度依賴性關(guān)系上調(diào)凋亡蛋白Caspase3表達(dá)水平(p＜0.05）;呈濃度依賴性關(guān)系下調(diào)凋亡蛋白Caspase9表達(dá)水平(p＜0.05）。④化合物BA體外抗肝癌的作用機(jī)制:BA對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路中相關(guān)蛋白表達(dá)的作用:BA干預(yù)SMMC-7721細(xì)胞后，WB分析結(jié)果顯示，BA能下調(diào)PI3K、P-Akt(Ser473)蛋白的表達(dá)水平(p＜0.

7、05），對(duì)Akt的表達(dá)無(wú)顯著影響(p＞0.05);BA聯(lián)合LY294002或IGF-1對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路中蛋白表達(dá)的作用:在SMMC-7721細(xì)胞中，BA聯(lián)合LY294002組與單用BA和LY294002組相比，PI3K、p-Akt(Ser473)蛋白的表達(dá)下降更顯著(p＜0.05); BA聯(lián)合IGF-1組與單用IGF-1組相比，PI3K、p-Akt(Ser473)蛋白的表達(dá)下降（p＜0.05）。
　　2、化合物BA的裸鼠

8、體內(nèi)抗肝癌作用
　?、貰A對(duì)裸鼠肝癌移植瘤的效應(yīng):BA能夠抑制裸鼠肝癌組織增長(zhǎng)(p＜0.05），其有效劑量為5mg/kg，抑瘤率為(58.24±27.51)％。②肝癌組織和臟器組織的形態(tài)變化:肝癌組織HE染色結(jié)果顯示，5mg/kgBA和10mg/kgBA組裸鼠的腫瘤組織出現(xiàn)壞死面積;BA治療組荷瘤鼠的肝臟、肺臟、腎臟及脾臟均無(wú)明顯的形態(tài)變化，與正常組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)較一致。③BA對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路中蛋白表達(dá)的作用:在肝癌腫瘤組

9、織中，BA干預(yù)后，Western Blot法與免疫組化分析結(jié)果均顯示，BA能下調(diào)PI3K、P-Akt蛋白的表達(dá)水平(p＜0.05），BA抗肝癌作用機(jī)制可能與阻斷PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1、化合物BA表現(xiàn)出體外抗肝癌活性，能抑制人肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡的作用。
　　2、化合物BA具有明確的體內(nèi)抗肝癌移植瘤生長(zhǎng)效應(yīng)，其有效劑量為5mg/kg。
　　3、化合物BA體內(nèi)外抗肝癌