視神經脊髓炎免疫球蛋白G檢測：方法學比較和臨床意義.pdf

1、研究背景：
　　 視神經脊髓炎(Neuromyelitis optica，NMO)與多發(fā)性硬化(multiplesclerosis，MS)在臨床上鑒別困難。臨床、組織病理學和免疫遺傳學的研究都提示NMO有著自身的特征，不同于MS。近年來，血清中的一種抗體，稱視神脊髓炎免疫球蛋白G(NMO-IgG)或水通道蛋白-4(Aquaporins-4，AQP-4)抗體，被認為是區(qū)分兩者的重要標志物。間接免疫熒光試驗(indirectimmu

2、nofluorescence assays,IFA)證實該抗體能結合小鼠軟腦膜、軟膜下、virchow-Robin腔及小腦、中腦、脊髓的灰白質交界微血管的AQP-4。
　　 文獻中已報道了多種檢測血清中NMO-IgG/AQP4抗體方法，包括了經典法(Original NMO-IgG assay)、放射免疫沉淀分析法(radioimmunoprecipitationassay,RIPA)，熒光免疫沉淀分析法(fluorescenc

3、eimmunoprecipitation assay,FIPA)、酶聯免疫吸附分析法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、AQP4抗體分析法(AQP4 antibody assay)、Western blot法、免疫組化法、流式細胞等方法。但是關于NMO-IgG/AQP4抗體的檢測及該抗體與NMO的關系仍然存在一些懸而未決的問題：(1)目前尚未見何種方法作為“金標準”被推薦應用于NMO-Ig

4、G/AQP4抗體的檢測；(2)在同批次的血清檢測中，不同檢測方法的檢測結果往往存在不一致性，尤其是經典法檢測的NMO-IgG，其靶抗原是否一定是AQP4目前尚存在疑問：(3)血清中的NMO-IgG/AQP-4抗體是區(qū)分MS與NMO的重要血清標志物，但是腦脊液中的該類抗體檢測是否等同于血清中的檢測尚未見深入的分析；(4)中國的脫髓鞘患者有別于西方國家，累及視神經和脊髓的患者比率更高，針對這一類患者我們采取何種防治方式的任務非常艱巨，所以早

5、期診斷與鑒別診斷國人NMO并闡明其發(fā)病機制意義重大。目前，國外對NMO-IgG/AQP4抗體與NMO的關系研究比國內深入，但是中國的NMO患者的NMO-IgG/AQP4抗體流行病學情況及其與臨床特征的關系很少有進行系統(tǒng)性的研究。
　　 研究目的：
　　 [1]建立檢測NMO-IgG/AQP4抗體的間接免疫熒光方法和描述其注意事項。
　　 [2]簡化NMO-IgG/AQP4抗體的間接免疫熒光程序，并比較C57小鼠、

6、SD大鼠、猴腦基質和轉染AQP4基因的HEK-293細胞基質對NMO-IgG/AQP4抗體的間接免疫熒光檢測效果的差別，篩選出NMO-IgG/AQP4抗體較理想的方法。
　　 [3]初步探討了不同方法檢測NMO-IgG/AQP4抗體結果不一致的可能原因。
　　 [4]探討細胞法檢測視神經脊髓炎患者腦脊液AQP4抗體的價值。
　　 [5]初步分析中國的NMO患者的AQP4抗體與臨床特征的關系。
　　 研究方

7、法：
　　 [1]免疫組化方法(鏈霉抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法法和間接免疫熒光法)檢測AQP4蛋白在在C57小鼠、SD大鼠、猴各器官組織和轉染AQP4基因的人胚腎細胞(HEK-293)的分布。
　　 [2]經典法檢測NMO-IgG：選擇C57小鼠小腦、中腦、腎臟和胃冰凍切片作為基質。人血清經稀釋、豚鼠肝粉預處理后，滴加于封閉液處理的上述切片，4℃過夜后滴加熒光素結合的羊抗人IgG的抗體，封片、熒光顯微鏡觀察。實驗通過

8、熒光雙標技術確定NMO-IgG結合部位與AQP4表達位置是否一致。
　　 [3]比較經典法和修改法檢測的差異：選取182血清樣本，經典法和修改法分別檢測上述血清的NMO-IgG，McNemar檢驗和Kappa檢驗評價兩種方法的診斷一致性，卡方檢驗比較兩種方法對NMO-IgG陽性率差異和臨床診斷價值。
　　 [4]對比不同基質檢測的差異：選擇來自于C57小鼠、SD大鼠、猴腦冰凍切片作為檢測NMO-IgG抗體的基質，轉染AQ

9、P4基因的HEK-293細胞作為檢測AQP4抗體的基質，猴胃、胰腺、腎冰凍切片和人臍靜脈內皮細胞作為檢測血管內皮細胞抗體的基質。來源于NMO、MS等脫髓鞘患者或其它對照患者的血清經稀釋處理后，滴加于上述基質，4℃孵育后、過夜后滴加熒光素結合的羊抗人IgG的抗體，封片、熒光顯微鏡觀察。McNemar檢驗和Kappa檢驗評價不同方法的診斷一致性，卡方檢驗評價不同方法對NMO診斷的臨床價值。
　　 [5]腦脊液中AQP4抗體的檢測：納

10、入130例患者腦脊液和血清，細胞檢測兩類體液的AQP4抗體，統(tǒng)計分析兩種體液中AQP4抗體對NMO的診斷價值。
　　 [6]臨床資料分析，采用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件，對比各種參數，行相關性分析。
　　 研究結論：
　　 [1]C57小鼠，SD大鼠和猴的中樞神經系統(tǒng)(軟腦膜、軟膜下、微血管、室管膜和小腦蒲肯野細胞)、胃、肺和腎組織均是AQP4主要表達豐富的部位，而轉染AQP4基因的人胚腎細胞(HEK-293)的

11、胞膜和胞質表達AQP4蛋白，提示它們能作為間接免疫熒光底物來檢測血清中靶向該種抗原的抗體。
　　 [2]以C57小鼠的小腦、腎臟和胃冰凍切片作為基質，通過間接免疫熒光經典法能成功檢測出人血清中的NMO-IgG抗體，有助于我們對視神經脊髓炎進行診斷與鑒別診斷。
　　 [3]修改小鼠腦間接免疫熒光法對NMO-IgG的檢測靈敏度和NMO總的診斷正確率高于經典法。
　　 [4]通過對C57小鼠、SD大鼠、猴腦基質和轉染A

12、QP4基因的HEK-293細胞基質檢測了NMO、MS、，ON、LETM及對照組血清中的IgG抗體，從臨床診斷指標(靈敏度與特異度)比較，細胞法檢測AQP4抗體具有高靈敏度和高特異性，推薦其應用于脫髓鞘患者的血清AQP4抗體檢測，有助于NMO和其相關綜合征的診斷。
　　 [5]通過多種中樞神經系統(tǒng)以外組織基質的熒光模式比較和人臍靜脈細胞證實，結合于腦微血管的NMO-IgG的靶抗原除了AQP4外，亦可能是血管內皮細胞抗體，NMO-I

13、gG對于判斷AQP4抗體不具有絕對的特異性。
　　 [6]細胞法檢測腦脊液中AQP4抗體的診斷正確率高于血清中的檢測，兩種體液的聯合檢測可以進一步提高診斷正確率。
　　 [7]AQP4抗體可能在CNS內首先產生，而血清中的AQP4抗體出現是繼發(fā)性的改變。
　　 [8]臨床確診的NMO患者幾乎均與AQP4抗體相關，AQP4抗體陰性患者可能很少見，而NMO高危綜合征患者(LETM，雙側視神炎或OSMS)大部分與AQP