人GRP78 miRNA重組腺病毒的構(gòu)建及其對(duì)腺苷誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡作用及其機(jī)制的影響.pdf

1、目的:
　　1.采用GatewayTM克隆技術(shù)構(gòu)建人GRP78 miRNA的重組腺病毒。
　　2.轉(zhuǎn)染腺病毒并聯(lián)合使用腺苷（Ado），檢測(cè)對(duì)HepG2細(xì)胞的藥理毒性效應(yīng)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）機(jī)制的變化。
　　方法：
　　1.從pcDNA6.2-GW/GRP78-1-miR質(zhì)粒中獲取GRP78 miRNA的有效片段。
　　2.采用GatewayTM克隆技術(shù)依次構(gòu)建入門克隆、表達(dá)克隆，轉(zhuǎn)入293A細(xì)胞包裝并完成

2、滴度測(cè)定。
　　3.重組腺病毒Ad-miR-GRP78轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，RT-PCR評(píng)價(jià)miRNA效果。
　　4. HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染Ad-miR-GRP78并聯(lián)合使用Ado，CCK-8（Cell Counting Kit-8）法檢測(cè)細(xì)胞增殖，Annexin V-PE染色、DAPI染核和TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，F(xiàn)CM/PI染色檢測(cè)細(xì)胞周期。
　　5. RT-PCR檢測(cè)ERS相關(guān)因子mRNA水平，細(xì)胞免疫化學(xué)和Wes

3、tern blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1.測(cè)序結(jié)果表明：干擾片段發(fā)生有效的重組反應(yīng)。
　　2.重組腺病毒Ad-miR-GRP78在293A細(xì)胞成功包裝，所測(cè)滴度為1.1×109pfu/ml。
　　3. Ad-miR-GRP78轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞48h，取MOI為20、50、100和200，GRP78 mRNA水平依次下降為(85±1.8)％、(78.5±3.6)%、(57.9±6.8)%和(40.

4、9±5.3)%，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。
　　4. CCK-8結(jié)果表明：下調(diào)GRP78可增強(qiáng)Ado誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用。
　　5. Annexin V-PE染色、DAPI染核和TUNEL法均證實(shí)：下調(diào)GRP78并聯(lián)合使用Ado，可顯著增強(qiáng)HepG2細(xì)胞的凋亡率。
　　6. FCM/PI染色結(jié)果表明：下調(diào)GRP78可協(xié)同Ado誘導(dǎo)的周期阻滯效應(yīng)。
　　7. RT-PCR、細(xì)胞免疫化學(xué)染色和West

5、ern blot的結(jié)果表明：下調(diào)GRP78并聯(lián)合使用Ado，可明顯活化ERS相關(guān)因子（caspase-4等）的mRNA和蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)論：
　　1、采用GatewayTM技術(shù)成功地構(gòu)建重組腺病毒Ad-miR-GRP78，并對(duì)HepG2細(xì)胞發(fā)揮有效的GRP78 miRNA作用。
　　2、下調(diào)GRP78可明顯增強(qiáng)Ado的細(xì)胞毒性效應(yīng)，包括Ado誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖抑制、凋亡和周期阻滯的效應(yīng)。
　　3、下調(diào)GRP78