用血漿多肽組學初步分離、篩查肺鱗癌血清標志物.pdf

1、目的：1.通過血漿采樣、多肽分離，尋找最大化提取、分離血漿多肽的試驗方法。
　　2.展示健康組及各鱗癌組多肽序列，并對其鑒定，比較分析正常人和肺鱗癌患者多肽差異，初步篩查肺鱗癌的血清標志物。
　　方法：用能穩(wěn)定血漿的P100試管（BD公司，美國）收集健康人血清48例，I期NSCLC標本10例，、II期NSCL C患者18例、III期NSCLC患者25例。利用有機溶劑沉淀法及高效液相色譜法（HPLC）分離多肽，利用基質輔助激光

2、解析電離飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）展示多肽組并對結果進行測序。通過電噴霧四級桿飛行時間串聯(lián)質譜（ESI-Q-TOF-MS）對各組樣本多肽測序，在 NCBI蛋白質（基因）數(shù)據(jù)庫中搜索蛋白或者多肽序列。根據(jù)國內外文獻參考及 MALDI-TOF-MS儀器參數(shù)，我們規(guī)定有效的ID序列將得分不低于20。將獲得的數(shù)據(jù)進行MS Blast分析。得肺癌病人和健康人血漿多肽組，比對健康人和肺癌病人多肽組差異。
　　結果：1.對于血漿多

3、肽組的幾個不同收集方法我們進行了詳細的對比分析。由于肺癌樣本難于采集，方法研究中所有血漿均為正常人血漿。通過文獻,我們進行了加熱滅活加高壓凝膠過濾收集；乙腈變性沉淀加高壓凝膠過濾收集；乙腈/丙酮變性沉淀加高壓凝膠過濾收集。三種方法通過實驗進行比較，我們發(fā)現(xiàn)加熱滅活方法中蛋白殘留量最高，有機溶解變性沉淀方法優(yōu)于加熱滅活方法，故選擇有機溶劑沉淀為優(yōu)先處理方法。對于有機溶劑沉淀，通過不同乙腈體積倍數(shù)沉淀方法發(fā)現(xiàn)2.5倍乙腈體積優(yōu)于其它倍數(shù)沉淀

4、方法。故我們選擇2.5倍體積乙腈沉淀與混合有機溶劑沉淀進行比較，發(fā)現(xiàn)4倍體積乙腈/丙酮/水沉淀優(yōu)于2.5倍體積乙腈沉淀方法，所以我們最終確定采用乙腈/丙酮/水沉淀方法為多肽組提取方法。同時，我們查閱文獻發(fā)現(xiàn)，增加氨水復溶以增加多肽組回收率。通過一系列實驗，最終確定多肽組提取方法為4倍體積混合溶劑（乙腈/丙酮/水=50/30/20）變性沉淀，變性時間為30分鐘，變性溫度為室溫。
　　2.利用電噴霧四級桿飛行時間串聯(lián)質譜（ESI-Q-

5、TOF-MS），對樣本中所含多肽分子進行測序，比對H組和LC1+2+3組多肽序列并將搜索到的肽段利用blast MS分析。分析后可得到所含肽鏈對應的蛋白。健康對照組搜索到852個肽段，LC1+2+3組搜索到1125個肽段。兩組肽段Scores評分均大于20有21個肽段。蛋白數(shù)據(jù)庫搜索得到對應蛋白。我們利用UniProt(www.uniport.org)篩選出8個有功能蛋白。八個蛋白分別是：metastasis-associated pr

6、otein MTA1/3、Matrix metalloproteinase-16 precursor、Cytokerantin-19、 haptoglobin isoform2 preproprotein、breast cancer type1 susceptibility protein isoform4/3/2/1、growth/differentiation factor15 precursor、Complement C3 pre

7、cursor、Complement componment C9。根據(jù)每組蛋白emPAI進行非標定量分析，統(tǒng)計得出差異蛋白。故我們推測蛋白 Matrix metalloproteinase-16 precursor可能為潛在肺鱗癌血清標志物。
　　結論：1.4倍體積混合溶劑（乙腈/丙酮/水=50/30/20）變性沉淀法為提取血漿多肽最有效方法。
　　2.蛋白Matrix metalloproteinase-16 precurs