恩度對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響及其與多西他賽聯(lián)合作用的觀察.pdf

1、本研究分為二部分： 第一部分、恩度對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞活化標(biāo)志的影響及其與多西他賽聯(lián)合作用的觀察 目的： 1.通過體外實(shí)驗(yàn)，模擬血管內(nèi)皮細(xì)胞的活化、增殖狀態(tài)。 2.檢測(cè)恩度、多西他賽、恩度+多西他賽對(duì)不同生長(zhǎng)狀態(tài)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞活化標(biāo)志的影響并研究其作用機(jī)制。 3.觀察恩度、多西他賽、恩度+多西他賽對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、凋亡及細(xì)胞周期的影響，并進(jìn)一步探討相關(guān)機(jī)制。 4.研究恩度與多西他賽的聯(lián)合

2、對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞是否具有協(xié)同作用，如果有，則進(jìn)一步探討聯(lián)合用藥的時(shí)間、順序及劑量與效應(yīng)的關(guān)系，探索相關(guān)機(jī)制，以指導(dǎo)臨床用藥。 方法： 1.應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期及TNF-α作用后的HUVEC細(xì)胞表面標(biāo)志物CD146、CD105的變化情況； 2.應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)恩度、多西他賽、恩度+多西他賽作用于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期及TNF-α作用后的HUVEC細(xì)胞后，其表面標(biāo)志物CD146、CD105的變化情況； 3.應(yīng)

3、用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)VEGF作用后的HUVEC細(xì)胞經(jīng)不同給藥方案作用后，其表面標(biāo)志物CD146、CD105和CD62E的變化情況； 4.應(yīng)用MTT法測(cè)定藥物對(duì)HUVEC細(xì)胞的增殖抑制率； 5.應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期； 6.應(yīng)用SPSS13．0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，分析HUVEC細(xì)胞表面標(biāo)志物與藥物作用間的關(guān)系。 結(jié)果： 1.不同狀態(tài)HUVEC細(xì)胞經(jīng)藥物作用后，表面標(biāo)志物CD14

4、6、CD105的檢測(cè)結(jié)果： （1）CD146的變化： 1）對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HUVEC經(jīng)藥物作用48h：對(duì)照、不同濃度恩度單藥與恩度300μg/ml+多西他賽組的CD146表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0．05）。 2）對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HUVEC中：①多西他賽作用24h與48h、24h與72h組；②恩度100μg/ml+多西他賽作用24h與72h組；③恩度300μg/ml+多西他賽作用24h與48h組，CD146表達(dá)差異均

5、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0．05）。 3）TNF-α作用后HUVEC經(jīng)藥物作用48h：①對(duì)照與恩度300μg/ml組；②恩度200μg/ml與恩度300μg/ml+多西他賽組；③恩度300μg/ml與恩度300μg/ml+多西他賽組，CD146表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0．05）。 （2）CD105的變化： 1）對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HUVEC經(jīng)藥物作用48h：①對(duì)照與多西他賽組；②對(duì)照與恩度300μg/ml+多西他賽組

6、；③恩度100μg/ml與恩度300μg/ml+多西他賽組；④恩度200μg/ml與恩度300μg/ml+多西他賽組⑤恩度100μg/ml+多西他賽與恩度300μg/ml+多西他賽組間，CD105表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0．05）。 2）TNF-α作用后的HUVEC經(jīng)藥物作用24h：對(duì)照與多西他賽組、對(duì)照與各聯(lián)合給藥組間，CD105表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0．05）。 3）TNF-α作用后的HUVEC：多

7、西他賽、三個(gè)聯(lián)合給藥組在24h與48h、24h與72h組間，CD105表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0．05）。 （3）對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HUVEC經(jīng)藥物作用48h后的CD146和CD105的變化趨勢(shì)：CD146和CD105表達(dá)變化呈線性趨勢(shì)，二者之間的相關(guān)系數(shù)為0．908（P=0．002）。 （4）TNF-α作用后的HUVEC經(jīng)藥物作用48h后的CD146和CD105的變化趨勢(shì)：CD146和CD105表達(dá)變化呈非線性趨勢(shì)，二者

8、之間的相關(guān)系數(shù)為-0．226（P=0．590）。 2.VEGF作用后的HUVEC細(xì)胞經(jīng)不同給藥方案作用，其表面標(biāo)志物CD146、CD105和CD62E的檢測(cè)結(jié)果： （1）CD146的變化： 1）對(duì)照或VEGF組與同時(shí)給藥、先多西他賽后恩度（序貫給藥1）組間，CD146表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0．05）。 2）恩度與多西他賽、同時(shí)給藥、序貫給藥1組間，CD146表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0．0

9、5）。 3）先恩度后多西他賽（序貫給藥2）與同時(shí)給藥、序貫給藥1組間，CD146表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0．05）。 （2）CD105的變化：各組間的CD105表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>0．05）。 （3）CD62E的變化： 1）對(duì)照與多西他賽、同時(shí)給藥、序貫給藥1組間，CD62E表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0．05）。 2）恩度與多西他賽、同時(shí)給藥、序貫給藥1組間，CD62E表

10、達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0．05）。 3）序貫給藥1與VEGF組、序貫給藥2組間，CD62E表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0．05）。 3.兩單藥對(duì)HUVEC細(xì)胞的增殖抑制作用：恩度對(duì)HUVEC作用48h后抑制率顯著升高，在96h～120h間穩(wěn)定于較高水平；多西他賽在48h時(shí)抑制率明顯升高。 4.不同給藥方案對(duì)HUVEC細(xì)胞的增殖抑制作用：聯(lián)合較單藥作用更明顯，聯(lián)合效應(yīng)中，同時(shí)給藥的抑制率最高（77．4％）

11、。 5.凋亡檢測(cè)提示，先多西他賽后恩度組的凋亡率最高（34．7％）。周期檢測(cè)提示，與對(duì)照組比較，恩度使G0/G1期細(xì)胞比例稍增加；多西他賽使G2/M期細(xì)胞比例增加；先多西他賽后恩度組的G0/G1期細(xì)胞比例增加；同時(shí)給藥使G2/M期細(xì)胞比例有所增加；先恩度后多西他賽使G0/G1期細(xì)胞比例略增加、G2/M期減少。 結(jié)論： 1.一定濃度的恩度及其聯(lián)合多西他賽均可下調(diào)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)皮細(xì)胞的CD146、CD105表達(dá)。

12、 2.在內(nèi)皮細(xì)胞過度激活狀態(tài)下，恩度在一定時(shí)間內(nèi)可能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞黏附、而對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用較弱，隨時(shí)間延長(zhǎng)，恩度又可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或壞死。多西他賽可直接抑制細(xì)胞活化、增殖、黏附，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或壞死。 3.一定濃度恩度聯(lián)合多西他賽抑制細(xì)胞活化、增殖、黏附，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或壞死的作用強(qiáng)于單藥，其中同時(shí)給藥與先多西他賽后恩度作用更顯著。先恩度后多西他賽作用不及多西他賽單藥，其機(jī)制可能與影響細(xì)胞周期分布及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等有關(guān)。 第

13、二部分、恩度對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響及其與多西他賽聯(lián)合作用的觀察 目的： 1.觀察恩度、多西他賽對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞EMMPRIN、MMP-2表達(dá)的影響。 2.觀察恩度、多西他賽、恩度+多西他賽對(duì)活化血管內(nèi)皮細(xì)胞形成管樣結(jié)構(gòu)的影響。 3.研究恩度與多西他賽聯(lián)合是否具有協(xié)同作用，如果有，則進(jìn)一步探討聯(lián)合用藥的時(shí)間、順序及劑量與效應(yīng)的關(guān)系，以指導(dǎo)臨床。 方法： 1.免疫組化法和Western blo

14、t實(shí)驗(yàn)觀察藥物對(duì)HUVEC細(xì)胞EMMPRIN、MMP-2蛋白表達(dá)的影響； 2.經(jīng)HUVEC管樣結(jié)構(gòu)形成實(shí)驗(yàn)，倒置相差顯微鏡下觀察活化血管內(nèi)皮細(xì)胞形成管樣結(jié)構(gòu)的能力及藥物對(duì)其的影響； 3.應(yīng)用SPSS13．0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，分析HUVEC細(xì)胞功能與藥物作用間的關(guān)系。 結(jié)果： 1.免疫組化結(jié)果顯示，藥物作用后，細(xì)胞形態(tài)與密度改變、EMMPRIN與MMP-2表達(dá)較對(duì)照組減弱。 2.West

15、ern blot實(shí)驗(yàn)顯示，EMMPRIN和MMP-2蛋白在對(duì)照組中的表達(dá)水平高于多西他賽及恩度單藥組。 3.HUVEC管樣結(jié)構(gòu)形成實(shí)驗(yàn)顯示，恩度單藥在一定時(shí)間內(nèi)可促進(jìn)HUVEC管樣結(jié)構(gòu)形成，隨作用時(shí)間延長(zhǎng)，管樣結(jié)構(gòu)形成能力降低；多西他賽可直接抑制管樣結(jié)構(gòu)形成；恩度聯(lián)合多西他賽較單藥抑制作用明顯，其中先多西他賽后恩度和同時(shí)給藥組抑制作用更顯著。 結(jié)論： 1.一定濃度的恩度與多西他賽均能減弱HUVEC細(xì)胞中的EMMP

16、RIN與MMP-2蛋白表達(dá)。 2.多西他賽可能因其細(xì)胞毒作用較強(qiáng)，可直接抑制內(nèi)皮細(xì)胞活化、增殖、黏附、管樣結(jié)構(gòu)形成，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或壞死，減少血管基底膜降解，降低血管通透性。 3.恩度在一定時(shí)間內(nèi)可能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞黏附，可能會(huì)增加內(nèi)皮細(xì)胞募集，促進(jìn)細(xì)胞分化，促進(jìn)管樣結(jié)構(gòu)形成與分化；其又可減少M(fèi)MPs對(duì)血管基底膜降解，故可能造成血管通透性降低、局部組織間質(zhì)液壓（IFP）下降及對(duì)血管壓力下降、從而使分布紊亂的血管重新排列，提示恩

17、度在一定時(shí)間內(nèi)可能具有血管正?；饔?。但隨作用時(shí)間延長(zhǎng)，其又可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或壞死，管樣結(jié)構(gòu)形成能力降低，故恩度的血管正?；饔每赡苁嵌唐谛?yīng)。 4.先多西他賽后恩度和同時(shí)給藥組抑制管樣結(jié)構(gòu)形成作用更明顯，可能一方面是因恩度與多西他賽聯(lián)合作用后，多西他賽顯示出更強(qiáng)的細(xì)胞毒性、更高的殺傷及破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)能力等。先恩度后多西他賽組的聯(lián)合效應(yīng)不如先多西他賽后恩度和同時(shí)給藥組，可能是因該序貫方式作用后，兩黏附分子表達(dá)均上調(diào)、有助于管樣結(jié)構(gòu)形