新型重組蛋白TAT-54R-KDEL的構(gòu)建和表達(dá)及其對(duì)CXCR4的表型敲除活性研究.pdf

1、研究表明，趨化因子受體CXCR4(CXC chemokine receptor4)與其特異性生理配體,基質(zhì)細(xì)胞衍生因子－1(stromal cell-derived factor-1，SDF-1)相互作用在多種惡性腫瘤轉(zhuǎn)移過程中起著關(guān)鍵作用。因而，CXCR4被認(rèn)為是有效防治腫瘤轉(zhuǎn)移的重要靶點(diǎn)。本課題組曾對(duì)SDF-1進(jìn)行遺傳改造，獲得了一種 CXCR4競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑：SDF-1/54R,并證實(shí)：SDF-1/54R可通過誘導(dǎo)CXCR4內(nèi)吞，使

2、細(xì)胞膜表面CXCR4迅速消失。但由于內(nèi)吞進(jìn)細(xì)胞的CXCR4又回到細(xì)胞膜表面重新利用，導(dǎo)致SDF-1/54R對(duì)CXCR4介導(dǎo)細(xì)胞遷移的抑制效應(yīng)也隨之消失[1]。因此，欲獲得真正具有臨床抗腫瘤轉(zhuǎn)移應(yīng)用價(jià)值的CXCR4拮抗劑，嘗試持久性阻斷CXCR4的技術(shù)路線是十分必要的。鑒于胞內(nèi)因子(intrakine)分子量小，特異性強(qiáng)，靶向性高等優(yōu)點(diǎn)，將胞內(nèi)因子表型敲除技術(shù)用于持久性阻斷腫瘤細(xì)胞CXCR4的表達(dá)不失為一種新思路。為此，課題組進(jìn)一步嘗試將

3、SDF-1/54R與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位片段KDEL嵌合，從而構(gòu)建了胞內(nèi)因子SDF-1/54R/KDEL的真核載體和腺病毒載體。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，轉(zhuǎn)染SDF-1/54R/KDEL基因的MOLT-4細(xì)胞膜表面CXCR4的表達(dá)量顯著降低,其轉(zhuǎn)移受到持久性抑制。然而，考慮到轉(zhuǎn)基因技術(shù)操作復(fù)雜，在整體應(yīng)用上安全性無法保證等局限，我們有必要進(jìn)一步嘗試直接向胞內(nèi)遞送趨化因子蛋白，在蛋白水平上實(shí)現(xiàn)CXCR4表型敲除以抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的可能性。為此，本課題借鑒穿膜肽的最

4、新研究成果，再次對(duì)SDF-1/54R/KDEL進(jìn)行基因改造，將其與高效穿膜載體即轉(zhuǎn)錄活化因子的TAT(47~57)片段（YGRKKRRQRRR）連接，從而構(gòu)建了一種新的嵌合蛋白：TAT/54R/KDEL。擬利用TAT(47~57)的高效穿膜能力和KDEL的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位作用，將CXCR4的特異性拮抗劑SDF-1/54R導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞，在蛋白水平上實(shí)現(xiàn)對(duì)其細(xì)胞膜表面CXCR4的敲除，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的目的。本研究結(jié)果將為證實(shí)這一防治腫瘤

5、轉(zhuǎn)移新策略的可行性和有效性提供直接的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為其它以CXCR4為靶點(diǎn)的腫瘤分子治療提供有益的參考價(jià)值。
　　目的：
　　對(duì)SDF-1/54R進(jìn)行二次基因改造，將其與高效穿膜載體TAT(47~57)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位片段KDEL連接，構(gòu)建一種新的嵌合蛋白：TAT/54R/KDEL，并在體內(nèi)外檢測(cè)其CXCR4表型敲除功能及對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制作用。
　　方法：
　?、僖员臼覙?gòu)建的重組質(zhì)粒GFP/pET-28a(+)和54R

6、/pET-28a(+)為模板，采用PCR方法擴(kuò)增GFP/KDEL和54R/KDEL基因，PCR產(chǎn)物酶切后插入pTAT-HA原核表達(dá)載體 TAT編碼區(qū)下游的多克隆位點(diǎn)，即獲得含有目的基因的重組質(zhì)粒TAT/GFP/KDEL/pTAT-HA和TAT/54R/KDEL/pTAT-HA。
　?、趯㈣b定正確的重組質(zhì)粒TAT/GFP/KDEL/pTAT-HA和TAT/54R/KDEL/pTAT-HA轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL21，用0.5μM IPTG誘

7、導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物采用Western blot法進(jìn)行鑒定。并利用表達(dá)產(chǎn)物N-端所帶的6×His-Tag融合標(biāo)簽，采用鎳離子親和層析和HPLC純化目的蛋白，由于嵌合蛋白TAT/GFP/KDEL為可溶表達(dá)，純化后的蛋白只需簡(jiǎn)單的透析、濃縮即可得到有活性的蛋白。而嵌合蛋白TAT/54R/KDEL以包涵體形式表達(dá)，純化后的蛋白需要聯(lián)合采用稀釋、透析和超濾的方法進(jìn)行復(fù)性。
　?、垠w外實(shí)驗(yàn)，首先檢測(cè)TAT/GFP/KDEL對(duì)高表達(dá)CXCR4的M

8、OLT-4細(xì)胞的穿膜能力和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位情況以考察本課題設(shè)計(jì)方案的可行性，然后分別利用熒光顯微鏡和熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)TAT/54R/KDEL對(duì)高表達(dá)CXCR4的MOLT-4細(xì)胞和不表達(dá)該受體的CNE2細(xì)胞的穿膜能力和靶向性,并利用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)TAT/54R/KDEL的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位情況。TAT/54R/KDEL的CXCR4表型敲除能力是其體外活性研究的重點(diǎn)，為此，我們首先采用流式細(xì)胞儀檢測(cè) TAT/54R/KDEL對(duì)MOLT-4細(xì)胞膜表面C

9、XCR4表達(dá)量的影響；然后利用趨化實(shí)驗(yàn)考察TAT/54R/KDEL對(duì)SDF-1誘導(dǎo)的MOLT-4細(xì)胞轉(zhuǎn)移的抑制作用；最后通過Western blot實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步評(píng)價(jià)TAT/54R/KDEL對(duì)細(xì)胞表面CXCR4表型敲除的作用效果。此外，還利用臺(tái)盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)和MTT法檢測(cè)了TAT/54R/KDEL的細(xì)胞毒性及其對(duì)細(xì)胞增殖的影響。
　　④將高表達(dá) CXCR4的小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1，原位接種于 BALB/c小鼠第2對(duì)乳房脂肪墊以建立小鼠乳腺

10、癌轉(zhuǎn)移模型，并利用該模型考察 TAT/54R/KDEL對(duì)移植部位乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的抑制效應(yīng)。進(jìn)一步采用RT-PCR和流式細(xì)胞儀檢測(cè)乳腺癌原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶的CXCR4和SDF-1表達(dá)量的變化，以探討TAT/54R/KDEL對(duì)乳腺癌轉(zhuǎn)移的抑制效應(yīng)與其CXCR4表型敲除能力之間的相互關(guān)系，從而初步闡明 TAT/54R/KDEL在體內(nèi)的作用機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　①以本室構(gòu)建的GFP/pET-28a(+)和54R/pET-28a(

11、+)為模板，PCR擴(kuò)增出目的基因GFP/KDEL和54R/KDEL，并采用PCR、酶切和測(cè)序方法證實(shí)目的基因已正確地插入pTAT-HA載體。
　?、谟肳estern blot法證實(shí)含有目的基因的重組質(zhì)粒 TAT/GFP/KDEL/pTAT-HA和TAT/54R/KDEL/pTAT-HA在BL21菌株中成功實(shí)現(xiàn)了高表達(dá)，采用鎳離子親和層析和HPLC純化得到了純度大于95％的目的蛋白 TAT/GFP/KDEL和TAT/54R/KDEL

12、。TAT/54R/KDEL經(jīng)稀釋、透析和超濾等處理后實(shí)現(xiàn)了復(fù)性。
　　③分別利用熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀和熒光酶標(biāo)儀證實(shí)TAT/GFP/KDEL具有高效的穿膜能力，并能準(zhǔn)確地定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，從而初步證實(shí)了本課題設(shè)計(jì)方案的可行性。與不表達(dá)CXCR4的CNE2細(xì)胞相比，TAT/54R/KDEL對(duì)高表達(dá)該受體的MOLT-4細(xì)胞具有更高的穿膜能力和靶向性，并且也能準(zhǔn)確地定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，為其進(jìn)一步實(shí)現(xiàn) CXCR4表型敲除奠定了基礎(chǔ)。采用流式細(xì)胞術(shù)

13、證實(shí) TAT/54R/KDEL對(duì)MOLT-4細(xì)胞表面 CXCR4具有持續(xù)地表型敲除能力。趨化實(shí)驗(yàn)表明TAT/54R/KDEL能夠有效地抑制SDF-1誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞遷移，Western blot實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)與SDF-1/54相比較，TAT/54R/KDEL對(duì)腫瘤細(xì)胞CXCR4的表型敲除效果更完全。臺(tái)盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)和MTT法證實(shí)TAT/54R/KDEL沒有細(xì)胞毒性，不影響CNE2細(xì)胞的增殖，而對(duì)MOLT-4細(xì)胞的增殖具有抑制作用。
　

14、?、軐⒏弑磉_(dá)CXCR4的乳腺癌細(xì)胞4T1原位接種于BALB/c小鼠第2對(duì)乳房脂肪墊成功建立了小鼠乳腺癌轉(zhuǎn)移模型，并利用該模型證實(shí) TAT/54R/KDEL對(duì)移植部位乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移具有抑制效應(yīng)。進(jìn)一步采用RT-PCR和流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)乳腺癌的轉(zhuǎn)移與細(xì)胞膜表面 CXCR4及轉(zhuǎn)移組織 SDF-1的高表達(dá)密切相關(guān)，TAT/54R/KDEL通過蛋白水平上CXCR4的表型敲除在一定程度上抑制了乳腺癌的轉(zhuǎn)移。
　　結(jié)論：
　?、俪晒?/p>

15、構(gòu)建了TAT/54R/KDEL的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，并且表達(dá)、分離純化出具有生物活性的TAT/54R/KDEL蛋白。
　?、?TAT/54R/KDEL具有高效的穿膜能力，并能準(zhǔn)確地定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，初步證實(shí)了本課題設(shè)計(jì)方案的可行性。
　?、垠w外實(shí)驗(yàn)證實(shí)TAT/54R/KDEL對(duì)MOLT-4細(xì)胞膜表面的CXCR4具有持續(xù)地表型敲除能力，并且能夠有效抑制SDF-1誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移。
　?、芡ㄟ^小鼠乳房脂肪墊移植4T1細(xì)胞，成功建立