Poly(A)尾的長(zhǎng)度對(duì)DHAV-1增殖的影響.pdf

1、A型鴨病毒性肝炎是由鴨甲肝病毒(Duck Hepatitis A virus，DHAV)引起的一種主要感染1～3周齡雛鴨急性和高度致死性的疾病。雛鴨死亡后有明顯的角弓反張神經(jīng)性癥狀，肝臟腫大且表面有出血點(diǎn)或者彌漫性出血。該病毒引起的鴨病毒性肝炎呈世界性分布，且具有高度傳染性，是嚴(yán)重危害養(yǎng)鴨業(yè)的主要疾病之一。隨著近兩年來(lái)人們對(duì)鴨病毒性肝炎的關(guān)注，DHAV的全基因組序列逐漸公布于世，但國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)該病的注意力集中在病原學(xué)研究及檢測(cè)方法研究，

2、對(duì)病毒的復(fù)制及感染機(jī)制研究仍然處于上世紀(jì)的組織學(xué)和血清學(xué)水平。眾多研究表明小RNA病毒科成員的復(fù)制和翻譯水平與病毒的5′UTR和3′UTR具有密切的關(guān)系，且poly(A)尾結(jié)構(gòu)對(duì)病毒的增殖和毒力均有重要作用。但目前尚無(wú)關(guān)于DHAV-1的poly(A)尾與病毒復(fù)制及毒力相關(guān)性的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)室前期已經(jīng)構(gòu)建了DHAV-1 LY0801株感染性克隆并成功獲得了拯救病毒粒子，拯救病毒粒子與母本病毒具有相似的增殖能力和毒力水平。但需要進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，

3、增加了實(shí)驗(yàn)繁瑣性和實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)。本課題在已經(jīng)構(gòu)建的感染性克隆基礎(chǔ)上，在病毒序列的兩端添加了兩個(gè)具有自我剪切性質(zhì)的核酶序列，構(gòu)建了具有更高轉(zhuǎn)染效率的DHAV-1 LY0801株DNA-Launched感染性克隆，直接轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒即可獲得拯救病毒粒子。同時(shí)通過(guò)引物設(shè)計(jì)增長(zhǎng)和縮短poly(A)尾的長(zhǎng)度，構(gòu)建一系列帶有不同長(zhǎng)度poly(A)尾的DNA-Launched感染性克隆，分別測(cè)定帶有不同長(zhǎng)度poly(A)尾的病毒的增殖和感染能力，以闡明DH

4、AV-1 poly(A)尾對(duì)病毒增殖和毒力的影響。
　　1、DHAV-1 LY0801株的DNA-Launched感染性克隆的構(gòu)建
　　參考載體pEGFP-N2多克隆位點(diǎn)區(qū)與DHAV-1忠實(shí)cDNA序列內(nèi)部酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)四對(duì)特異性引物將DHAV-1全基因組分為4個(gè)片段定向克隆到載體。通過(guò)引物設(shè)計(jì)的方法在病毒基因組的兩端添加兩個(gè)具有自我剪切性質(zhì)的核酶錘頭狀核酶(hammerhead ribozyme)與丁型肝炎病毒核酶(hep

5、atitis delta virus ribozyme)。通過(guò)引物設(shè)計(jì)，人工誘變第3042位堿基(T→C)并形成一個(gè)序列中本身不存在的BamHI位點(diǎn)，且該堿基突變未引起氨基酸序列的改變。新形成的BamHI位點(diǎn)作為遺傳標(biāo)簽區(qū)分母本病毒與拯救病毒粒子。
　　將DHAV-1 DNA-Launched感染性克隆進(jìn)行全基因組測(cè)序后發(fā)現(xiàn)除3042位堿基為人工誘變外，其他堿基及氨基酸序列均未發(fā)生突變。將重組質(zhì)粒進(jìn)行定量后直接轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞

6、，并以母本病毒感染BHK-21細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照，以無(wú)菌的PBS為陰性對(duì)照。轉(zhuǎn)染60h后收集細(xì)胞培養(yǎng)物并反復(fù)凍融三次后，接種空白BHK-21細(xì)胞。連續(xù)傳代三次后，在感染60h后進(jìn)行CPE的觀察和IFA、RT-PCR的檢測(cè)。經(jīng)鑒定結(jié)果均為陽(yáng)性，表明成功獲得拯救病毒粒子。
　　2、拯救病毒的部分生物學(xué)特性研究
　　轉(zhuǎn)染60h后收集細(xì)胞培養(yǎng)物，反復(fù)凍融三次后感染空白BHK-21細(xì)胞。連續(xù)傳代三次后，感染6孔板中的BHK-21細(xì)胞，每

7、隔12h分別收集細(xì)胞上清及細(xì)胞，母本病毒和無(wú)菌PBS感染BHK-21作為陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定各個(gè)時(shí)間段病毒增殖和毒力特點(diǎn)。細(xì)胞和細(xì)胞上清中的增殖特點(diǎn)表明拯救病毒粒子和母本病毒粒子具有相似的增殖和毒力特點(diǎn)。
　　為了衡量拯救病毒與母本病毒的毒力水平，將60只雛鴨分別分為三個(gè)組。第一組和第二組分別為拯救病毒組和母本病毒組，分別腿部肌肉注射0.25ml(104TCID50)的拯救病毒和母本病毒，對(duì)照組腿部肌肉注射0

8、.25ml無(wú)菌PBS，結(jié)果顯示拯救病毒與母本病毒具有相似的毒力，死亡雛鴨表現(xiàn)為明顯的鴨病毒性肝炎臨床癥狀。
　　為了確定拯救病毒粒子與母本病毒粒子具有相似的組織嗜性，將100只雛鴨隨機(jī)分為兩組，分別腿部肌肉注射0.25ml(104TCID50)的拯救病毒和母本病毒粒子，攻毒后1h，6h，12h，18h，24h，48h和72h后分別收取雛鴨的心臟，肝臟，腎臟，脾臟，胸腺和法氏囊組織并用實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定組織中的病毒含量。組織切片

9、結(jié)果表明兩組病毒均可引起典型的鴨病毒性肝炎臨床癥狀。表明拯救病毒與母本病毒具有相似的組織嗜性。
　　3.Poly(A)尾的長(zhǎng)度對(duì)DHAV-1的增殖和毒力的影響
　　通過(guò)引物設(shè)計(jì)的方法，將poly(A)尾的長(zhǎng)度分別突變?yōu)?/5/10/15/20/25/30/40個(gè)堿基A，獲得一系列帶有不同長(zhǎng)度poly(A)尾的DNA-Launched感染性克隆。將帶有不同長(zhǎng)度poly(A)尾的DNA-Launched感染性克隆轉(zhuǎn)染BHK-21

10、細(xì)胞后，每隔12h分別收集細(xì)胞上清和細(xì)胞，提取病毒RNA，并用DNasI消除殘留DNA的影響，實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定病毒拷貝數(shù)，并繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)。細(xì)胞組中的增殖特點(diǎn)為24hpt到48hpt細(xì)胞內(nèi)病毒拷貝數(shù)逐漸下降，從48hpt到60hpt病毒拷貝數(shù)又開(kāi)始上升。細(xì)胞上清組中的病毒拷貝數(shù)特點(diǎn)為24hpt到48hpt細(xì)胞上清中的病毒拷貝數(shù)逐漸上升，而后在48hpt到60hpt病毒拷貝數(shù)又開(kāi)始下降。細(xì)胞內(nèi)的病毒拷貝數(shù)代表病毒在BHK-21細(xì)胞中的

11、增殖特點(diǎn)，試驗(yàn)結(jié)果表明poly(A)25組感染性克隆具有最高的復(fù)制水平。細(xì)胞上清中本身不存在病毒RNA，因此細(xì)胞上清中的病毒拷貝數(shù)代表病毒的感染能力，試驗(yàn)結(jié)果表明poly(A)20組具有最高的病毒毒力水平。此外，細(xì)胞中病毒增殖特點(diǎn)與細(xì)胞總內(nèi)容物中的增殖特點(diǎn)相似，表明細(xì)胞中的病毒含量遠(yuǎn)大于細(xì)胞上清中的病毒含量。
　　4.Poly(A)0組DNA-Launched感染性克隆拯救病毒粒子增殖特點(diǎn)研究
　　在poly(A)長(zhǎng)度對(duì)DH

12、AV-1增殖相關(guān)性試驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞組中poly(A)0組DNA-Launched感染性克隆拯救病毒粒子在48hpt后病毒拷貝數(shù)開(kāi)始上升。為了確定無(wú)poly(A)尾DHAV-1能否增殖，將poly(A)0組DNA-Launched感染性克隆轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞并收集細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物。細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物反復(fù)凍融三次后接種空白BHK-21細(xì)胞，連續(xù)傳代三次后進(jìn)行RT-PCR、IFA檢測(cè)。經(jīng)鑒定結(jié)果均為陽(yáng)性，表明成功獲得了拯救病毒粒子。這充分說(shuō)明pol

13、y(A)尾對(duì)DHAV-1的增殖和感染不是必需的。
　　為了研究無(wú)poly(A)尾DHAV-1的增殖和毒力特點(diǎn)，將轉(zhuǎn)染后產(chǎn)物分別在BHK-21細(xì)胞及健康鴨胚中傳代20代，用3’RACE試劑盒分別檢測(cè)不同代次poly(A)的長(zhǎng)度，并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定病毒拷貝數(shù)。試驗(yàn)結(jié)果表明，無(wú)poly(A)尾的病毒基因組能夠組裝成完整的病毒粒子，并且可以在健康鴨胚和BHK-21細(xì)胞中增殖，但是與母本病毒相比，無(wú)poly(A)尾的DHAV-1具