帕金森病致病基因產(chǎn)物L(fēng)RRK2蛋白之LRR主域功能的體外研究.pdf

1、目的：應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)和免疫熒光技術(shù)研究野生型和變異型LRR(I1122V)主域在體外與parkin分子之間是否存在相互作用，為逐個(gè)解析LRRK2蛋白其他主域的功能，全面探討LRRK2蛋白在帕金森病發(fā)病機(jī)制中作用的后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。 方法：通過分子克隆技術(shù)構(gòu)建誘餌pGBDU-LRR質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染進(jìn)入酵母菌成為PJ69-4α/pGBDU-LRR菌株，應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)在獵物書架中篩選出可能與野生型LRRK2蛋白的LRR主域存在相互作

2、用的蛋白。隨后分別轉(zhuǎn)染含F(xiàn)LAG標(biāo)記的PRK5-parkin質(zhì)粒(對(duì)照組)，HA標(biāo)記的野生型pCMV-LRR質(zhì)粒+PRK5-parkin質(zhì)粒(實(shí)驗(yàn)組1，parkin+LRR(W))，HA標(biāo)記的變異型pCMV-LRR質(zhì)粒+PRK5-parkin質(zhì)粒(實(shí)驗(yàn)組2，parkin+LRR(M))，采用Hoechst染色試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡，wesmm blot檢測(cè)parkin蛋白和野生型/變異型LRR主域的表達(dá)，免疫熒光技術(shù)進(jìn)一步觀察野生型/變異型

3、LRR主域在細(xì)胞內(nèi)是否共定位，免疫沉淀技術(shù)證實(shí)LRR主域在體外與。parkin分子之間是否存在相互作用。 結(jié)果：通過酵母雙雜交系統(tǒng)從獵物書架中篩選出parkin分子可能與野生型LRR主域之間存在相互作用，通過共同轉(zhuǎn)染野生型/變異型pCMV-HA-LRR質(zhì)粒和PRK5-FLAG-parkin質(zhì)粒進(jìn)入HEK293細(xì)胞，western blot檢測(cè)到parkin蛋白和野生型/變異型LRR主域在HEK293細(xì)胞成功表達(dá)，免疫熒光技術(shù)觀察

4、到parkin在細(xì)胞胞漿中表達(dá)(綠色熒光)，野生型LRR亦在細(xì)胞胞漿中表達(dá)(紅色熒光)，融合后，可見parkin與野生型LRR共同轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞胞漿呈橙色，說明兩者之間在細(xì)胞內(nèi)共定位，可能存在相互作用；然而變異型LRR在HEK293細(xì)胞的胞核中形成包涵體，融合后核內(nèi)的包涵體仍然為紅色，說明parkin與變異型LRR在體外表達(dá)時(shí)細(xì)胞內(nèi)定位不同，兩者之間沒有相互作用。免疫沉淀實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)parkin分子與野生型LRR主域之間存在相

5、互作用。Hoechst染色發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡比率較對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組1明顯升高，免疫熒光也表明實(shí)驗(yàn)組2的細(xì)胞核內(nèi)有類似于路易體的包涵體形成，所以我們建立了帕金森病的細(xì)胞模型。 結(jié)論：野生型LRRK2蛋白的LRR主域在體外表達(dá)時(shí)與parkin位于細(xì)胞內(nèi)同一亞結(jié)構(gòu)，兩者之間存在相互作用。突變的LRR主域(I1122V)與parkin之間的相互作用缺失。變異型LRRK2蛋白之LRR主域與parkin在體外共同表達(dá)時(shí)可以形成類似路易體樣的細(xì)胞核內(nèi)