針刺大鼠內(nèi)關(guān)穴對(duì)鹽酸多巴酚丁胺正性肌力作用的增效機(jī)制研究.pdf

1、研究背景
　　 以靶向性和效應(yīng)都非常明確的藥物,即心肌細(xì)胞β1-腎上腺素能受體(β1-adrenergic receptor,β1-AR)激動(dòng)劑一鹽酸多巴酚丁胺(DobutamineHydrochloride,DH)為探針,觀察針刺大鼠內(nèi)關(guān)穴對(duì)DH的增效作用,并在此基礎(chǔ)上通過(guò)對(duì)血藥濃度和靶器官藥物濃度的比較分析,以及對(duì)穴位針刺后靶器官受體后信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上一系列信號(hào)成分及其對(duì)選擇性藥物反應(yīng)性的檢測(cè),分析靶器官受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上哪個(gè)

2、或哪些信號(hào)成分參與介導(dǎo)了針刺對(duì)DH的增效作用,從而系統(tǒng)闡明穴位針刺對(duì)藥物增效作用的受體后機(jī)制。
　　 方法：
　　 一、針?biāo)幗Y(jié)合增效作用的觀察確定
　　 實(shí)驗(yàn)用清潔級(jí)健康雄性SD大鼠120只,隨機(jī)分為正常對(duì)照(NC)組、常規(guī)靜脈注射(intravenous injection,Ⅳ)組、常規(guī)肌肉注射(intramuscular injection,IM)組和電針內(nèi)關(guān)穴+穴位注射(EA-IN)組,各組動(dòng)物在記錄10

3、min正常對(duì)照數(shù)據(jù)后,再分別以不同的方式進(jìn)行給藥。Ⅳ組注射部位為右側(cè)股靜脈；IM組注射部位為右后肢臀部肌肉豐厚處；EA-IN組在電針雙側(cè)“內(nèi)關(guān)”穴10 min后,穴位注射DH。分別觀察比較同劑量的DH在上述不同途徑給藥及干預(yù)下左心室內(nèi)壓(LVSP)、左室壓力上升最大變化速率(+dp/dtmax)、心率(HR)的變化,以確定穴位針刺對(duì)DH的增效作用。
　　 二、不同途徑給藥后血藥濃度的比較研究
　　 采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(LC

4、-MS/MS)觀察比較在上述不同途徑給予相同劑量DH后2、5、15 min三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血藥濃度的差異,以判斷血藥濃度的改變是否是穴位針刺特異性增效作用的機(jī)制之一。
　　 三、不同途徑給藥后靶器官藥物濃度的比較研究
　　 采用LC—MS/MS觀察比較在上述不同途徑給予相同劑量DH后2、5、15 min三個(gè)時(shí)間點(diǎn)時(shí)在靶器官-心肌組織中的該藥物濃度差異,以判斷增加藥物靶器官濃度是否是穴位針刺特異性增效作用的機(jī)制之一。
　

5、　 四、心肌細(xì)胞β1-AR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在針?biāo)幗Y(jié)合增效中的作用分析
　　 在第一部分工作證明EA-IN組增強(qiáng)心臟功能的效應(yīng)優(yōu)于常規(guī)肌肉注射的基礎(chǔ)上,設(shè)正常對(duì)照(NC)組、電針內(nèi)關(guān)(EA)組,觀察比較心肌細(xì)胞β1-AR的數(shù)量及其反應(yīng)性、Gs-蛋白含量、腺苷酸環(huán)化酶(AC)的反應(yīng)性、cAMP含量、蛋白激酶A(PKA)的反應(yīng)性、L-型Ca2+通道的反應(yīng)性,來(lái)分析靶器官受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上哪個(gè)或哪些信號(hào)成分參與介導(dǎo)了不同穴位針刺引起的特異

6、性藥物的增效作用。具體實(shí)驗(yàn)方法如下:
　　 a.采用免疫印跡法(Western Blotting)觀察比較心肌細(xì)胞β1-AR的含量,并以熒光染料Fura-2為鈣標(biāo)記,測(cè)量單個(gè)心肌細(xì)胞內(nèi)鈣對(duì)β1-AR激動(dòng)劑DH的反應(yīng)性,以探討穴位針刺是否通過(guò)改變其特異性靶器官-心臟β1-AR的數(shù)量或反應(yīng)性,進(jìn)而達(dá)到對(duì)DH的特異性增效作用；
　　 b.采用Western Blotting方法測(cè)定心肌細(xì)胞Gs-蛋白含量,以探討不同穴位針刺是否

7、通過(guò)改變?chǔ)?-AR后信號(hào)成分-Gs-蛋白,進(jìn)而達(dá)到對(duì)DH的特異性增效作用；
　　 c.以熒光染料Fura-2為鈣標(biāo)記,測(cè)量單個(gè)心肌細(xì)胞內(nèi)鈣對(duì)AC激動(dòng)劑Forskolin的反應(yīng)性,以探討不同穴位針刺是否通過(guò)改變?chǔ)?-AR后信號(hào)成分-AC,進(jìn)而達(dá)到對(duì)DH的增效作用；
　　 d.采用ELISA法測(cè)定心肌cAMP含量,以探討不同穴位針刺是否通過(guò)改變?chǔ)?-AR后信號(hào)成分-cAMP,進(jìn)而達(dá)到對(duì)DH的增效作用；
　　 e.以熒

8、光染料Fura-2為鈣標(biāo)記,測(cè)量單個(gè)心肌細(xì)胞內(nèi)鈣對(duì)PKA激動(dòng)劑DB—cAMP的反應(yīng)性,以探討不同穴位針刺是否通過(guò)改變?chǔ)?-AR后信號(hào)成分-PKA,進(jìn)而達(dá)到對(duì)DH的增效作用；
　　 f.以熒光染料Fura-2為鈣標(biāo)記,測(cè)量單個(gè)心肌細(xì)胞內(nèi)鈣對(duì)鈣通道激動(dòng)劑-Bay—K8644的反應(yīng)性,以探討不同穴位針刺是否通過(guò)改變?chǔ)?-AR后信號(hào)成分-鈣通道,進(jìn)而達(dá)到對(duì)DH的增效作用。
　　 結(jié)果：
　　 一、藥理效應(yīng)
　　

9、以LVSP、+dp/dtmax、HR為檢測(cè)指標(biāo),經(jīng)不同途徑給予DH后觀察到:2min時(shí)EA-IN組和IV組藥理作用相當(dāng)(P>0.05),但EA-IN組比Ⅳ組維持時(shí)間長(zhǎng)(P<0.01),尤其5 min時(shí)EA-IN組的作用明顯強(qiáng)于其他各組,給藥15 min時(shí)EA-IN組的作用強(qiáng)度與IM組相當(dāng)(P>0.05),且強(qiáng)于Ⅳ組(P<0.01)。
　　 二、血藥濃度
　　 注射DH后2 min時(shí),Ⅳ組血藥濃度增加最為明顯,EA-IN組

10、血藥濃度雖低于Ⅳ組(P<0.01),但明顯高于IM組(P<0.01)。在注射后5 min時(shí),Ⅳ組血藥濃度下降至2 min時(shí)的一半,而EA-IN組血藥濃度與2min時(shí)血藥濃度相仿,且高于同時(shí)間點(diǎn)IM組的血藥濃度(P<0.01)。在注射后15 min時(shí),Ⅳ組血中DH基本上代謝完畢,而EA-IN組血藥濃度仍維持在較高水平,且明顯高于同時(shí)間點(diǎn)IM組血藥濃度的水平(P<0.05)。
　　 三、靶器官-心肌組織藥物濃度
　　 注射D

11、H后2 min時(shí),各組動(dòng)物心肌組織中的藥物濃度均有不同程度的增加,其中以Ⅳ組和EA-IN組增加最為明顯,且明顯高于IM組(P均<0.01)。在注射后5 min時(shí),Ⅳ組心肌組織中的藥物濃度迅速下降,而EA—IN組心肌組織中的藥物濃度與2 min時(shí)相比繼續(xù)升高,并高于Ⅳ組和IM組(P<0.01,P<0.05)。在注射后15 min時(shí),EA-IN組和IM組的心肌組織中的藥物濃度基本仍維持在同一較高水平(P>0.05),IM組高于Ⅳ組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)

12、心肌組織中的藥物濃度(P<0.05)。
　　 四、β1-AR后信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑分析
　　 電針內(nèi)關(guān)穴后,其心肌細(xì)胞膜上β1-AR蛋白水平有增高趨勢(shì),且EA組大鼠分離的單個(gè)心肌細(xì)胞在DH作用下鈣瞬變的波幅與NC組單個(gè)心肌細(xì)胞在DH作用下鈣瞬變的波幅比較亦有增加的趨勢(shì),但兩組β1-AR相關(guān)指標(biāo)的差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；
　　 電針后心肌細(xì)胞膜上Gsα蛋白水平與NC組心肌細(xì)胞膜Gsα蛋白水平相比有增高趨勢(shì),但兩組差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

13、；
　　 EA組大鼠分離的單個(gè)心肌細(xì)胞在Forskolin作用下鈣瞬變的波幅與NC組單個(gè)心肌細(xì)胞在Forskolin作用下鈣瞬變的波幅比較增加的幅度明顯升高(P<0.05),提示電針內(nèi)關(guān)穴增強(qiáng)了心肌細(xì)胞對(duì)AC激動(dòng)劑Forskolin的反應(yīng)性；
　　 EA組大鼠心肌組織cAMP含量與NC組大鼠心肌組織cAMP含量比較有增加的趨勢(shì),但兩組差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；
　　 EA組大鼠分離的單個(gè)心肌細(xì)胞在DB-cAMP作用下鈣瞬

14、變的波幅與NC組單個(gè)心肌細(xì)胞在DB-cAMP作用下鈣瞬變的波幅比較有增加的趨勢(shì),但兩組差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；
　　 EA組大鼠分離的單個(gè)心肌細(xì)胞在Bay K-8644作用下鈣瞬變的波幅與NC組單個(gè)心肌細(xì)胞在Bay K-8644作用下鈣瞬變的波幅比較亦有增加的趨勢(shì),但兩組差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：
　　 上述結(jié)果表明,針刺內(nèi)關(guān)對(duì)DH確有增效作用,其機(jī)制可能涉及以下三個(gè)方面:①針刺穴位能夠通過(guò)影響DH的血藥濃度,從