BCL11A在中國(guó)急性髓系白血病病人中的表達(dá)水平及其調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、目的：選取5個(gè)急性髓系白血病(AML)相關(guān)基因，對(duì)新診斷的中國(guó)和歐洲血統(tǒng)占主要優(yōu)勢(shì)的西方AML患者進(jìn)行基因突變差異比較。研究BCL11A在中國(guó)AML患者中的表達(dá)水平。對(duì)BCL11A上游調(diào)控機(jī)制進(jìn)行深入研究，包括轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)鑒定，啟動(dòng)子活性分析，髓系分化關(guān)鍵調(diào)控因子CEBPα在BCL11A啟動(dòng)子上結(jié)合位點(diǎn)的鑒定以及CEBPα對(duì)BCL11A的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究。進(jìn)一步探討B(tài)CL11A在白血病發(fā)生過(guò)程中起到的致癌基因作用。
　　方法：⑴收集A

2、ML患者骨髓樣本269例，PCR擴(kuò)增NF1，TP53，NRAS，F(xiàn)LT3，DNMT3A5個(gè)AML相關(guān)基因并進(jìn)行測(cè)序鑒定，分析鑒定其突變情況。⑵TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量方法，精確定量AML患者中BCL11A的表達(dá)水平，并與12例正常人骨髓樣本進(jìn)行比較，分析其表達(dá)是否失調(diào)。⑶生物信息學(xué)分析及5'-RACE方法對(duì)BCL11A轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)進(jìn)行鑒定。⑷構(gòu)建BCL11A啟動(dòng)子及啟動(dòng)子系列缺失體，通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)分析啟動(dòng)子活性。對(duì)活性顯

3、著的啟動(dòng)子再次進(jìn)行生物信息學(xué)分析，分析其可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。⑸通過(guò)構(gòu)建CEBPA相關(guān)表達(dá)載體，與BCL11A啟動(dòng)子共轉(zhuǎn)染，CEBPA突變，啟動(dòng)子結(jié)合位點(diǎn)突變等實(shí)驗(yàn)鑒定CEBPα對(duì)BCL11A啟動(dòng)子活性的影響。⑹通過(guò)過(guò)表達(dá)CEBPA實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其對(duì)內(nèi)源BCL11A表達(dá)的影響。⑺構(gòu)建HL-60細(xì)胞分化模型，通過(guò)分化等實(shí)驗(yàn)來(lái)研究ATRA誘導(dǎo)HL-60髓系分化過(guò)程中BCL11A所起的作用。
　　結(jié)果：①NF1，TP53，DNMT3A，NR

4、AS，F(xiàn)LT3在中國(guó)AML患者中的突變頻率分別為0，＜1％，6％，7％，23％。且這5個(gè)基因突變與臨床特征包括年齡、性別、FAB-type和細(xì)胞遺傳學(xué)等沒(méi)有顯著的聯(lián)系。除FLT3-ITD外，其余四個(gè)基因在中國(guó)AML患者中的突變頻率均低于歐洲血統(tǒng)占主要優(yōu)勢(shì)的西方AML患者。②BCL11A在中國(guó)AML患者中表達(dá)失調(diào)，表現(xiàn)出一定的高表達(dá)。③5'-RACE實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)BCL11A存在新轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，在NCBI公布的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)基礎(chǔ)上繼續(xù)向上游延伸1

5、42bp。④BCL11A新轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游500bp堿基序列具有顯著的啟動(dòng)子活性。⑤轉(zhuǎn)錄因子CEBPα抑制BCL11A啟動(dòng)子活性，且抑制作用隨著CEBPA表達(dá)時(shí)間的延長(zhǎng)和表達(dá)量的增加而加深。CEBPA基因突變后，抑制作用消失。對(duì)BCL11A啟動(dòng)子上CEBPα可能的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變后，BCL11A啟動(dòng)子活性上升約40％。⑥CEBPA過(guò)表達(dá)抑制內(nèi)源BCL11A表達(dá)。⑦HL-60細(xì)胞分化過(guò)程中，CEBPA表達(dá)水平上升，BCL11A表達(dá)水平

6、降低，兩者呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。而過(guò)表達(dá)BCL11A則會(huì)抑制HL-60細(xì)胞分化。
　　結(jié)論：本研究發(fā)現(xiàn)與西方研究相比，AML發(fā)生密切相關(guān)的基因在中國(guó)AML患者中突變頻率普遍偏低，提示在中國(guó)AML的發(fā)生發(fā)展中可能有其他基因通過(guò)其他尚未被發(fā)現(xiàn)的機(jī)制起作用。首次發(fā)現(xiàn)BCL11A在中國(guó)AML患者中表達(dá)失調(diào)。并在隨后的BCL11A分子遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究中鑒定了新的BCL11A轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，還首次發(fā)現(xiàn)髓系分化過(guò)程中關(guān)鍵的調(diào)控因子CEBPα可能作為一個(gè)主要