慢性心衰大鼠下丘腦室旁核內(nèi)NF-κB與血漿醛固酮、心肌細(xì)胞凋亡的關(guān)系.pdf

1、目的：慢性心力衰竭(CHF)是各種心臟疾病的終末階段，以心室重構(gòu)和神經(jīng)內(nèi)分泌過度激活為基本特征的臨床綜合征。隨著社會(huì)進(jìn)入老齡化，心血管疾病發(fā)病率的增高，CHF的發(fā)病率正逐年上升。下丘腦室旁核(PVN)作為內(nèi)臟活動(dòng)和神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)的重要核團(tuán)，是調(diào)控交感神經(jīng)傳出活動(dòng)最重要的中樞位點(diǎn)和整合部位。研究證實(shí)心衰時(shí)PVN內(nèi)神經(jīng)化學(xué)因素如活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)、炎性細(xì)胞因子(proinflammatory

2、cytokines，PIC)等的改變，可能是促發(fā)心衰時(shí)交感神經(jīng)傳出增加的重要因素。核因子-κB(NF-κB)廣泛分布于全身細(xì)胞和組織，在免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)等過程中參與眾多因子的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程。近年來研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB在心衰大鼠重要的心血管調(diào)節(jié)中樞PVN內(nèi)表達(dá)明顯增多，NF-κB通過一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑介導(dǎo)CHF時(shí)循環(huán)細(xì)胞因子的中樞作用，誘導(dǎo)炎性反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，參與心力衰竭的發(fā)病機(jī)制。慢性心衰時(shí)循環(huán)中高水平的醛固酮亦可通過中樞效應(yīng)影響心

3、室重建，其主要通過心肌的醛固酮受體介導(dǎo)心肌肥厚和心肌重構(gòu)，其增加是心衰發(fā)生的獨(dú)立的危險(xiǎn)因素。本研究采用冠脈左前降支結(jié)扎術(shù)致急性心肌梗死制備大鼠CHF模型，飲水中分別給予NF-κB拮抗劑吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽(PDTC)及選擇性鹽皮質(zhì)激素受體拮抗劑依普利酮(EPL)干預(yù)處理后，觀察血漿醛固酮水平與PVN內(nèi)NF-κB蛋白表達(dá)的變化對(duì)心衰進(jìn)程的影響，探討其相互作用及其對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的調(diào)控，為心衰的中樞研究及治療探索新的思路。
　　 方

4、法：⑴成年健康雄性SD大鼠70只，體重250～300g，由山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為：慢性心衰組(CHF組)和假手術(shù)組(SHAM組)。CHF組行冠脈左前降支結(jié)扎術(shù)致急性心肌梗死，制備大鼠CHF模型；假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎。CHF組再隨機(jī)分為未治療組(CHF組，n=20)、NF-κB抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽干預(yù)組(PDTC組，n=20)和鹽皮質(zhì)激素受體拮抗劑依普利酮干預(yù)組(EPL組，n=20)，假手術(shù)組(SHAM組，n=1

5、0)作為正常對(duì)照。治療組大鼠飲水中分別給予PDTC(150 mg/kg/d)，或EPL(30 mg/kg/d)，治療持續(xù)6周。⑵6周后，測(cè)定左心室濕重/體重比(LVW/BW(mg/g))，右心室濕重/體重比(RVW/BW(mg/g))和肺濕重/體重比(LW/BW(mg/g))評(píng)價(jià)心功能及心衰程度。⑶大鼠頸動(dòng)脈血注入冰水預(yù)冷的EDTA抗凝管中，混勻后離心(4℃，3000rpm，10min)，取上清置于Tube管中，采用放射免疫法測(cè)定血漿醛

6、固酮水平。⑷制備心肌組織石蠟標(biāo)本，心肌細(xì)胞凋亡采用TUNEL法檢測(cè)。細(xì)胞核呈棕褐色或者呈棕黃色者為凋亡陽性細(xì)胞，光鏡下判定其分布情況，每張切片拍攝5個(gè)陽性視野。心肌細(xì)胞凋亡率是凋亡陽性細(xì)胞數(shù)占觀察心肌細(xì)胞數(shù)的比例，心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)(％)=(心肌細(xì)胞凋亡細(xì)胞核數(shù)/正常心肌細(xì)胞核數(shù))×100％。應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。⑸提取下丘腦室旁核蛋白后，采用Western blot檢測(cè)下丘腦室旁核內(nèi)NF-κB蛋白水平。蛋白采用聚丙

7、烯酰胺變性凝膠方法分離，蛋白經(jīng)電轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，脫脂奶粉封閉2h，分別加入小鼠抗兔NF-κBp65(1:200)，4℃孵育過夜，辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(1:2000)，37℃孵育2h，化學(xué)發(fā)光試劑顯影，顯影膠片應(yīng)用UVP凝膠圖像掃描系統(tǒng)掃描吸光度，實(shí)驗(yàn)組吸光度值與對(duì)照組吸光度值比值即為結(jié)果。蛋白表達(dá)水平以其與β-actin光密度比值來表示。應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。
　　 結(jié)果：①CHF組大鼠左心室濕重/體

8、重比(LVW/BW(mg/g))，右心室濕重/體重比(RVW/BW(mg/g))和肺濕重/體重比(LW/BW(mg/g))均明顯高于SHAM組，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。飲水中給予PTDC或EPL治療后各項(xiàng)心功能指標(biāo)均降低，且EPL組低于PTDC組，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，該實(shí)驗(yàn)大鼠心力衰竭模型成功建立。②光鏡下凋亡陽性細(xì)胞為細(xì)胞核呈黃褐色。與SHAM組(9.68±8.40％)比較，CHF組(36.82±6.3

9、4％)心肌凋亡陽性細(xì)胞數(shù)明顯增高，組間差異有極顯著性(P<0.01)。與CHF組比較，EPL組(24.21±6.44％)可明顯降低心肌細(xì)胞凋亡，組間差異有極顯著性(P<0.01)，而PDTC組(34.24±5.92％)亦有降低作用，組間差異有顯著性(P<0.05)；EPL組與PDTC組間差異有極顯著性(P<0.01)，提示EPL抑制心肌細(xì)胞凋亡作用遠(yuǎn)大于PDTC組，EPL在抑制心肌細(xì)胞凋亡、改善心衰癥狀方面，療效大于PDTC。③CHF組

10、(0.30±0.07)血漿醛固酮水平顯著高于SHAM組(0.14±0.07)(P<0.01)；與CHF組(0.30±0.07)比較，EPL組(0.20±0.12)可顯著降低血漿醛固酮水平(P<0.01)，PTDc組(0.28±0.12)無明顯降低醛固酮的作用(P>0.05)。EPL組與PTDC組比較，兩組間差異有極顯著性(P<0.01)，而與SHAM組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。④Westem blot結(jié)果 EPL組(0.5

11、4±0.14)、PDTC組(0.70±0.11)、CHF組(0.83±0.31)PVN內(nèi)NF-κB蛋白表達(dá)較SHAM組(0.27±0.10)依次升高。各組PVN內(nèi)NF-κB表達(dá)與SHAM組相比，差異均有極顯著性(P<0.01)；CHF組與EPL組比較，組間差異有極顯著性(P<0.01)，與PDTC組比較，組間差異有顯著性(P<0.05)；EPL組與PDTC組組間差異有顯著性(P<0.05)。
　　 結(jié)論：⑴CHF組大鼠血漿醛固酮

12、水平明顯高于SHAM組。⑵CHF組大鼠PVN內(nèi)NF-κB表達(dá)明顯增多，其水平與心衰的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。NF-κB可能在心力衰竭的進(jìn)程中發(fā)揮了重要作用，抑制其活性有可能成為治療心衰的一個(gè)新靶點(diǎn)。⑶慢性心衰大鼠血漿醛固酮水平與PVN內(nèi)NF-κB的表達(dá)有相關(guān)性，心衰時(shí)循環(huán)中高濃度的血漿醛固酮可激活PVN內(nèi)的NF-κB，且PVN內(nèi)活化的NF-κB可介導(dǎo)心衰過程中心肌細(xì)胞凋亡，影響心衰的發(fā)生、發(fā)展。外周途徑抑制血漿醛固酮或中樞NF-κB水平，均可