低氧預適應對自體原位肝移植大鼠肝細胞HIF-1及EGR-1表達影響的實驗研究.pdf

1、1目的
　　 本實驗在大鼠自體原位肝移植(AOLT)模型基礎上，通過對供肝大鼠術前低氧預適應(HP)處理，探討HP肝移植大鼠術后肝細胞的功能、結構變化，低氧誘導因子-1(Hypoxia-inducible Factor-1，HIF-1)表達與早期生長反應因子1(early growth responsefactor-1 EGR-1)的相互關系。
　　 2方法
　　 2.1清潔SD純系大鼠隨機分為3組：低氧預適應大

2、鼠自體原位肝移植組(A組n=36)：供體術前行HP(術前給予氣體流量5 L/min的含8％氧的氮氧混合氣體處理90 min)，8 h后行大鼠自體肝移植；大鼠自體肝移植組(B組n=36)：大鼠行自體原位肝移植；正常大鼠對照組(C組n=6)。兩組肝移植大鼠均采用門靜脈灌注的自體原位肝移植模型。
　　 2.2比較大鼠自體肝移植術后不同時間段的指標變化。各組大鼠切取肝中葉及抽取下腔靜脈血作為標本，在光鏡、透射電鏡下觀察肝細胞病理學改變、

3、肝細胞線粒體的損傷情況，檢測肝功能指標變化，RT-PCR技術檢測肝臟組織HIF-1RNA和TNF-α RNA表達的變化結果，Western蛋白印跡法檢測肝臟組織EGR-1的變化結果。
　　 3結果
　　 3.1手術成功的標準是術后大鼠即刻蘇醒，翻身，并能維持有效呼吸、心跳。經(jīng)門靜脈灌注，肝臟熱缺血時間可以忽略不計(一般<5s)。無肝期結束后，A組肝臟復色均勻，紅潤，很快即有膽汁流出。B組較A組復色差，膽汁分泌差。

4、　　 3.2各組肝功能測定結果表明：
　　 術后2hA組和B組的ALT和AST值最高，術后12h及24hALT和AST值慢慢恢復正常。在各時間段中，A組的血清ALT和AST水平顯著低于B組，但均顯著高于C組，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。
　　 3.3光鏡下術后各組肝細胞的病理變化：
　　 肝組織結構的術后2h改變，A組術后2h，肝小葉結構基本正常，肝細胞輕微腫脹，肝組織無明顯改變；B組術后2h，中央靜

5、脈周圍的肝細胞明顯腫脹，肝細胞之間的間隙變寬，肝血竇變窄，肝小葉結構不明顯，內(nèi)有淤積的紅細胞和血栓，周圍開始出現(xiàn)炎癥細胞浸潤；C組術后2h，肝細胞結構正常，無炎癥細胞浸，肝組織無明顯改變。術后12h A組肝細胞腫脹略重，肝組織無明顯改變；B組肝細胞水腫加劇，肝血竇明顯變窄，肝小葉結構不明顯，內(nèi)有淤積的紅細胞和血栓，周圍開始出現(xiàn)炎癥細胞浸潤；C組肝細胞無明顯改變。術后24h，A組肝細胞腫脹輕微好轉，肝血竇變寬。B組，肝細胞明顯腫脹，肝血竇

6、變窄，肝小葉結構不明顯；C組術后2h肝組織無明顯改變。
　　 3.4透射電子顯微鏡下各組肝細胞中線粒體：
　　 術后2h，A組大鼠線粒體腫脹較輕，橢圓形，周圍內(nèi)質網(wǎng)結構尚存；B組，線粒體大小不一，明顯腫脹，呈類圓形；術后12h，A組大鼠線粒體腫脹略加重，內(nèi)嵴部分斷裂，但仍有少量排列。周圍內(nèi)質網(wǎng)結構尚存；B組線粒體腫脹加劇，嚴重者可見嵴減少、斷裂或消失，周圍內(nèi)質網(wǎng)結構破壞；術后24h，A組大鼠線粒體腫脹略輕，損壞未加劇，周

7、圍內(nèi)質網(wǎng)結構尚存；B組線粒體腫脹加劇，內(nèi)有空泡變性，可見嵴斷裂或消失嚴重；
　　 3.5 HIF-1RNA表達結果：
　　 C組中肝組織見少量HIF-1α的表達，各時間段無明顯波動；B組因術中灌肝缺氧致有HIF-1α RNA表達，可見表達量介于對照組和低氧預適應組，術后表達量波動增強不明顯；而A組因術前低氧誘導致HIF-1RNA的表達比B組和C組更明顯，其表達量見表一：術后1小時HIF-1α/GAPDH為0.82，之后持

8、續(xù)升高，6小時HIF-1/GAPDH最高為1.25(誤差率<5％)。
　　 3.6 TNF-α RNA表達結果：
　　 C組中肝組織見少量TNF-α的表達，各時間段無明顯波動；A組TNF-α RNA表達，可見表達量介于對照組和低氧預適應組；而B組TNF-α RNA的表達比低氧預適應大鼠自體肝移植組和對照組更明顯(P<0.05)，與Egr-1蛋白表達呈正相關。其表達量見：術后2小時TNF-α/GAPDH為0.77，之后持續(xù)

9、升高，24小時TNF-α/GAPDH最高為1.44(誤差率<5％)。
　　 3.7 Western蛋白印跡檢測：
　　 C組檢測到Egr-1蛋白表達量較少。B組和A組的Egr-1蛋白表達量術后都增多，其中B組明顯增多。Egr-1的WB數(shù)據(jù)顯示：B組因術中肝臟缺血等損傷致Egr-1移植后12 h即有明顯表達增多，Egr-1/action為0.78，移植后24 h其表達增至最高值Egr-1/action為1.005。至48小