器官型腦片培養(yǎng)OGD復(fù)氧模型中丁苯酞對(duì)于bcl-2-bax及bim蛋白的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、目的:建立大腦皮層的器官型腦片氧糖剝奪模型(OxygenandGlucoseDeprivation，OGD)，觀察OGD復(fù)氧模型中丁苯酞(NBP)對(duì)細(xì)胞凋亡中bcl-2、bax及bim蛋白的調(diào)節(jié)作用。
　　 方法:用生后7天的SD(SpragueDawley)乳大鼠，制備大腦皮層運(yùn)動(dòng)區(qū)的器官型腦片，用膜插件的方法進(jìn)行體外培養(yǎng)，觀察其形態(tài)。2周后，將腦片隨機(jī)分為對(duì)照組（C組）、模型組（M組）、溶劑對(duì)照組（MT組）和實(shí)驗(yàn)組（T10組

2、），每組九片，更換含有Propidiumiodide（PI，1μg/ml）的培養(yǎng)液，孵育20min，倒置熒光顯微鏡下拍照（4X，曝光時(shí)間1.038ms，靈敏度ISO1600），后模型組、溶劑對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組采用厭氧罐氧剝奪，更換無糖培養(yǎng)液（含PI）的方式，進(jìn)行OGD干預(yù)30min，之后更換正常糖含量培養(yǎng)液，溶劑對(duì)照組更換同實(shí)驗(yàn)組等量溶劑(DMSO)的正常培養(yǎng)液(含PI)，實(shí)驗(yàn)組更換含NBP(10μM)的正常培養(yǎng)液（含PI），對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組

3、同一時(shí)間更換兩次正常培養(yǎng)液。分別在干預(yù)前和恢復(fù)正常條件后不同時(shí)間點(diǎn)(1h、24h、72h)，觀察PI染色。另外，對(duì)照組、模型組和實(shí)驗(yàn)組，重復(fù)上述干預(yù)（培養(yǎng)液不添加PI），復(fù)氧6小時(shí)后用戊二醛固定，并做石蠟切片，進(jìn)行HE染色及對(duì)各組進(jìn)行bcl-2、bax、bim蛋白的免疫組化染色。
　　 結(jié)果:
　　 1體外培養(yǎng)的腦片存活良好，未見明顯的壞死區(qū)域。2周的腦片，進(jìn)行HE染色，可見正常的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。
　　 2PI染色可見

4、對(duì)照組在不同的時(shí)間點(diǎn)熒光強(qiáng)度并未發(fā)生明顯變化（P＞0.05），模型組和溶劑對(duì)照組可見熒光強(qiáng)度在OGD復(fù)氧1h后有明顯增強(qiáng)，之后在24h、72h逐漸增強(qiáng)。兩組進(jìn)行各時(shí)間點(diǎn)比較其熒光強(qiáng)度未見明顯差異(P＞0.05)。
　　 3實(shí)驗(yàn)組熒光強(qiáng)度也呈現(xiàn)逐漸增強(qiáng)趨勢(shì)，但與模型組比較，在24h、72h其熒光強(qiáng)度均低于模型組。
　　 4免疫組化染色可見對(duì)照組、模型組和實(shí)驗(yàn)組處理后6小時(shí)的石蠟切片中。bcl-2蛋白:模型組和實(shí)驗(yàn)組陽性細(xì)胞

5、數(shù)均增多，實(shí)驗(yàn)組增多更明顯，三組差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;bax蛋白:模型組和實(shí)驗(yàn)組陽性細(xì)胞數(shù)均增多，模型組增多更明顯，三組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;bim蛋白:模型組和實(shí)驗(yàn)組陽性細(xì)胞數(shù)均增多，模型組增多更明顯，三組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論:
　　 1出生后7天的SD乳鼠可以作為體外腦片培養(yǎng)的腦組織供體，并且可以以此為平臺(tái)，對(duì)腦細(xì)胞進(jìn)行不同條件的刺激來研究神經(jīng)細(xì)胞的不同反應(yīng);
　　 2OGD模型可以誘導(dǎo)腦片